[发明专利]通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送

说明书

本文提供经修饰的衣壳蛋白、分离的多核苷酸、用于制备经修饰的衣壳蛋白的方法、重组病毒颗粒、用于产生经修饰的病毒颗粒的重组表达系统、以及基因编辑和调控的方法。

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2018年3月16日提交的美国临时申请序列号62/644,317的优先权，其全文通过引用并入本文。

关于政府支持的申明

本发明是在国家卫生研究院和国家转化科学促进中心授予的拨款82081315号的政府支持下完成的。在本发明中政府享有一定的权利。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全文通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2019年2月26日，名为106887-7170_SL.txt，大小为18,492字节。

背景

人们已经做了修饰AAV衣壳以改善基因递送的努力。例如，WO2017/165859A1描述了一种病毒衣壳修饰，其中Cas9与病毒衣壳蛋白融合或结合以促进可定制的基因编辑。进一步的参考文献描述了使用DNA家族改组（Grimm和Kay）、对AAVrh74进行赖氨酸替换（US 2015/006556）、AAVrh74的195、199、201或202位突变（US 9,840,719）和对AAVrh48的修饰（EP2359866）。更进一步的参考文献详细描述了在AAV表面上示出的随机肽文库（例如，Muller(2003) Nat. Biotechnol., Perabo (2003) Mol. Ther., and 7,588,722 (Grimm andKay)）。

肌营养不良症的基因治疗方法需要基因向全身肌肉细胞的全身递送。最有效的递送方式是利用人体的循环系统以将病毒散布到周围的肌肉细胞。全身递送的一个问题是，大多数血清型的AAV具有感染肝细胞的自然倾向[1]。在体内，肝细胞是肌肉细胞的大约20倍，而病毒必须在全身传递时穿过[2]。据估计，全身静脉内注射后，超过50％的AAV载体保留在肝脏中。

目前，超过50％的全身性注射的病毒在肝脏中损失，在其中通常无法实现治疗效果[4]。通过将脱靶（de-targeting）载体递送至肝脏并增加肌肉特异性结合和转导，可以显著改善肌肉特异性基因表达和对患者的治疗效果，同时减少潜在的副作用。目前，用于治疗杜兴（Duchene）肌营养不良症的临床试验要求递送高水平的载体（每公斤 5E + 12个载体基因组），以尝试达到肌肉中基因表达的治疗水平。肌肉特异性启动子可用于减少“脱靶”基因表达，但对增加基因表达的总体水平没有作用。通过增加肌肉特异性转导的效率，可以显著降低获得治疗益处所需的总剂量。

本公开解决了现有技术的限制并且还提供了相关的优点。

概述

申请人提出了一种增加载体向肌肉细胞的全身递送的方法可以减少或消除病毒循环时肝细胞的感染。申请人假设，经修饰的AAVrh74衣壳比未经修饰的AAVrh74载体更有效地靶向肌肉成肌细胞和卫星细胞。

本公开涉及经修饰的病毒衣壳蛋白，其包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。申请人已经产生了三个突变体。突变体之一（AAVmut4，在VP1衣壳的氨基酸502处的天冬酰胺变为异亮氨酸）增加对所有测试组织的全身基因递送，将转导效率提高高达56倍（根据组织，增加3至56倍）。另一个突变体（AAVmut5，在VP1衣壳的氨基酸505处色氨酸变为精氨酸）向心脏的基因递送比AAVrh74增加了几乎50倍。第三个突变体（AAVYIG或AAVYIGSR591）靶向主要存在于被认为是肌肉干细胞的卫星细胞上的受体，尽管尚未通过IHC染色确认卫星细胞趋向性（tropism）。值得注意的是，基于申请人对AAV晶体结构和α7β1整合蛋白的了解，设计AAVYIG或AAVYIGSR591被认为对骨骼肌具有较高的亲和力且对肝脏具有较低的亲和力。