[发明专利]浮力激活细胞分选(BACS)兼容的激活/转导系统和方法

说明书

本文公开了一种在密闭容器中使包含靶细胞与包含脂质壳气核微泡的微泡试剂的宿主液体，以及一种或多种结合到靶细胞上的细胞表面分子的抗体或其他配体进行接触的方法，其中所述一种或多种抗体或其他配体结合到靶细胞或微泡上，其中接触是在产生通过一种或多种抗体或其他配体连接到微泡的靶细胞的条件下进行，以及激活靶细胞以生成活化的靶细胞。

交叉引用

本发明享有2018年3月14日提交的申请号为No.62/643081的美国临时专利申请的优先权，其以全部引用的方式包含于本文中。

背景技术

人类淋巴细胞的基因修饰在治疗性活细胞疗法(如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞)的开发和制造中是一个日益重要的步骤。CAR-T细胞，比如FDA批准的首个用于治疗急性淋巴细胞白血病的KYMRIAH(Tisagenlecleucel)，是患者自己的(自体的)T淋巴细胞经过复杂、昂贵和费时的实验室过程后制备成的可杀死癌症的细胞。

如今，CAR-T细胞的制造过程通常包括以下连续步骤：(1)对患者血液实施白细胞去除术，以浓缩大量自体白细胞，然后将“白细胞分离产品(leukapheresis product)”从门诊运输到制造实验室；(ii)对白细胞分离产品进行初步细胞分级，以制备更接近纯的单核细胞悬浮液(MCs)，即具有更少量污染的非单核细胞(通常通过使用Ficoll^TM或类似的可溶性聚合物作为密度剂的密度梯度离心来实现)，产生所谓的外周血单核细胞制剂(PBMCs)；(iii)再进行一轮纯化以从PBMCs中分离出更接近纯净的CD3⁺淋巴细胞(这是制备CAR-T细胞的起始材料的特定细胞类型)，如今通常使用将磁性纳米颗粒与抗CD3抗体偶联的磁性激活细胞分选技术(MACS)获得；随后(iv)“激活”分离出的CD3⁺细胞，使其易于将外源DNA整合至其染色体中(激活通常是将细胞暴露于与抗CD3/抗CD28抗体偶联的微珠中在培养基中培养1-3天来完成的)；随后(v)进行被称为“转导”的过程，其中所述活化的CD3⁺细胞与基因工程腺病毒载体接触，所述载体含有编码嵌合(两部分)跨膜融合蛋白的人工基因构建体，所述融合蛋白包括细胞外抗CD19单链抗体片段和细胞内T细胞信号传导蛋白(CD3-ζ)和共刺激(4-1BB)结构域(所谓的嵌合抗原受体，或CAR)。最后，将患者转导的、表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)在培养基中扩增(允许繁殖)，以产生治疗剂量(在Tisagenlecleucel中0.2×10⁶-2.5×10⁸个可行的CAR-T细胞)的表达CAR的T细胞，用于在淋巴衰竭化疗后通过静脉输注返回患者体内。

此处概述的KYMRIAH制造工艺与当今仅有的FDA批准的其他CAR-T细胞治疗剂Yescarta(axicabtagene ciloleucel，用于弥漫性大B细胞淋巴瘤)大体相似，因为其与世界上目前正在临床前开发或临床试验中的越来越多的其他转基因淋巴细胞治疗候选药物也类似。从商业化的角度来看，这些制造过程的一个显著特征是其复杂、劳动密集型和低效的特性，导致了这些救命的治疗剂成本极高(Yescarta或KYMRIAH单的剂量疗程费用分别为$373,000或$475,000)。按照当今的惯例，所述制造范例通常涉及数十个连续的液体处理步骤，并将过程中的材料转移至新容器中(伴随着相关细胞的损失)，并且，由于细胞分离和细胞洗涤步骤会产生额外的细胞损失，导致相对的效率低下(靶细胞的回收率低)，从而又必须通过额外的用于细胞扩增的时间(消耗昂贵的细胞培养基并施加额外的液体处理步骤，以及对体内潜在的细胞增殖能力产生负面影响)进行补偿，以获得治疗剂量。这种复合的生产效率低下和冗长的制造过程不仅对产品的成本产生了负面影响，更重要的是，对重症患者的预后产生了负面影响，因为如果有治疗剂的话其会影响及时制造有效治疗剂量的可能性。

发明内容