[发明专利]分离方法

说明书

本发明涉及分离免疫球蛋白变体的方法，其包括以下步骤：a)提供填充有Fc结合亲和色谱树脂的柱；b)将包含至少两种含Fc的免疫球蛋白变体的样品加载到柱上；c)任选地用洗涤液洗涤柱；和d)输送洗脱剂通过所述柱，以从所述柱中至少洗脱目标免疫球蛋白变体，并且回收包含富集形式的目标免疫球蛋白变体的一个或多个洗出液级分。

发明技术领域

本发明涉及亲和色谱领域，并且更具体地涉及使用具有蛋白A的突变结构域的亲和分离树脂，对蛋白A具有不同亲和力的免疫球蛋白的差异分离。

发明背景

免疫球蛋白代表全世界制造或开发中最流行的生物制药产品。关于这种特定治疗剂市场的高商业需求以及因此其价值，已导致将重点放在制药公司上，以在控制相关成本的同时，最大化其各自mAb制造工艺的生产率。

在大多数情况下，亲和色谱用作这些免疫球蛋白分子(例如单克隆抗体或多克隆抗体)的纯化中的关键步骤之一。一类特别有利的亲和试剂是能够特异性结合免疫球蛋白分子的恒定部分的蛋白质，此类相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。此类试剂可以广泛地用于来自不同样品的免疫球蛋白的亲和色谱回收，所述样品例如但不限于血清或血浆制剂或者细胞培养物衍生的原料。此类蛋白质的一个实例是葡萄球菌蛋白A，其含有能够结合来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域。这些结构域通常表示为E、D、A、B和C结构域。

由于其高亲和力和选择性，基于葡萄球菌蛋白A (SpA)的试剂已在生物技术领域中(例如，在用于抗体的捕获和纯化以及用于检测或定量的亲和色谱中)发现广泛的用途。目前，基于SpA的亲和介质很可能是最广泛使用的亲和介质，用于从不同样品(包括工业细胞培养上清液)中分离单克隆抗体及其片段。因此，包含蛋白A-配体的各种基质是商购可得的，例如呈重组蛋白A (例如MabSelect^TM，GE Healthcare)和突变的碱稳定的蛋白A变体(例如MabSelect SuRe和MabSelect PrismA，GE Healthcare)的形式。

这些蛋白A基质通常用于免疫球蛋白与细胞培养物中存在的其它蛋白质的分离。然而，还需要在细胞肉汤中存在的免疫球蛋白的不同变体之间的分离。这特别适用于双特异性抗体和多特异性抗体，其连同显著量的不需要的免疫球蛋白变体(例如半抗体、同二聚体抗体等)一起表达。

发明概述

本发明的一个方面是提供在亲和捕获步骤中直接分离免疫球蛋白变体的方法。这通过包括以下步骤的方法来实现：

a)提供填充有Fc结合亲和色谱树脂的柱；

b)将包含至少两种含Fc的免疫球蛋白变体的样品加载到柱上；

c)任选地用洗涤液洗涤柱；和

d)输送洗脱剂通过柱，以从柱中至少洗脱目标免疫球蛋白变体，并且回收包含适当地呈富集形式的目标免疫球蛋白变体的一个或多个洗出液级分。

优选地，步骤以如上文列出的次序执行。

定义

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可互换使用，并且理解为还包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白、以及包含抗体或抗体片段的缀合物。关于由本发明涵盖的示例抗体和免疫球蛋白的详细讨论，参见下文。

术语“Fc结合多肽”和“Fc结合蛋白”分别意指能够结合抗体的可结晶部分(Fc)的多肽或蛋白质，并且包括例如蛋白A和蛋白G，或者其已维持所述结合特性的任何片段或融合蛋白。