[发明专利]生产目标蛋白质的宿主细胞

说明书

一种经改造的真核宿主细胞，以产生异源目标蛋白质(POI)，该真核宿主细胞经过基因修饰，以减少三种不同内源宿主细胞蛋白质(HCP)中至少一种的产生，以及它在生产POI的方法中的用途。

技术领域

本发明涉及在真核宿主细胞中的蛋白质生产，该宿主细胞经改造，以减少宿主细胞培养物中的杂质。

背景技术

真核细胞培养物中产生的蛋白质作为诊断剂和治疗剂已变得越来越重要。基于此目的，需要对细胞进行改造和/或选择，以产生异常高水平的目标的重组或异源的蛋白质。细胞培养条件的优化对于重组或异源的蛋白质的成功商业化生产很重要。从宿主细胞释放的副产物作为宿主细胞蛋白质(HCP)，并在培养物中积累，给重组或异源蛋白质的纯化带来困难，或者可能对产品功效或患者安全性构成风险。

除哺乳动物宿主细胞外，酵母和丝状真菌通常被用作生物制药的蛋白质、以及大宗化学品(bulk chemicals)的生产宿主。甲基营养型酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))，因有效分泌异源蛋白质而闻名。巴斯德毕赤氏酵母已被重新分类为一个新的属Komagataella，并分为三个物种：K.pastoris、K.phaffii和K.pseudopastoris。通常地，用于生物技术应用的菌株属于两个建议的物种，K.pastoris和K.phaffii。菌株GS115、X-33、CBS2612和CBS7435是K.phaffii，而蛋白酶缺陷型菌株的SMD系列(例如，SMD1168)被分类为K.pastoris，这是所有可用的巴斯德毕赤酵母菌株的参考菌株。(Mattanovich etal.2009,Microb Cell Fact.8:29；Kurtzman 2009,J Ind Microbiol Biotechnol.36(11):1435-8)。

由多基因序列分析确定，Komagataella(毕赤酵母属)毕赤酵母的生物技术菌株为Komagataella phaffii。

Mattanovich等人(Microbial Cell Factories 2009,8:29doi:10.1186/1475-2859-8-29)描述了K.pastoris的DSMZ 70382型菌株的基因组测序，并分析了其分泌蛋白质组和糖转运蛋白。

Huang等人(Appl Microbiol Biotechnol.2011 Apr；90(1):235-47.doi:10.1007/s00253-011-3118-5.Epub 2011 Feb 9.)描述了甲醇诱导培养物中巴斯德毕赤酵母分泌蛋白质的蛋白质组学分析，识别在甲醇诱导的巴斯德毕赤酵母X-33发酵培养物中分泌或释放到培养基中的蛋白质。

Heiss等人(Appl Microbiol Biotechnol.2013 Feb；97(3):1241-9.doi:10.1007/s00253-012-4260-4.Epub 2012 Jul 17)识别了一种细胞外蛋白质X1(Epx1)，将其作为巴斯德毕赤酵母的主要污染宿主细胞蛋白质，产生抗体Fab片段。研究发现EPX1通常不会上调，只有当处于不同的胁迫环境(stress situation)时才会上调。产生了各自的缺失菌株(Δepx1)，并发现所述缺失菌株比野生型对细胞壁破坏剂(荧光增白剂和刚果红)更敏感，这表明Epx1可能对细胞壁具有保护作用。在野生型和Δepx1菌株之间，没有观察到生长和产物形成的显著差异。

但是，我们发现Epx1p不是一种高丰度的蛋白质，在巴斯德毕赤酵母细胞培养物中的总的HCP不到约3％(mol/mol)。

HCP是由生产过程中使用的细胞或生物产生或编码的蛋白质，并且与预期产品无关。有些对于生长、存活和正常的细胞加工是必需的，而另一些则可能不是必需的。无论用途如何，或缺乏其用途，HCP在最终药物中通常是不需要的。尽管通常以少量(ppm，以每毫克所需蛋白质的纳克表示)，但工业上去除它们需要花费大量的努力和成本。

需要开发适合于生产和/或纯化异源和/或重组蛋白质的改良宿主细胞。