[发明专利]使用成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白修饰免疫相关基因组基因座在审
| 申请号： | 201980025684.1 | 申请日： | 2019-04-12 |
| 公开（公告）号： | CN112384621A | 公开（公告）日： | 2021-02-19 |
| 发明（设计）人： | 季清洲;G·D·戴维斯;J·T·兰伯思 | 申请（专利权）人： | 西格马－奥尔德里奇有限责任公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/90 |
| 代理公司： | 中国专利代理(香港)有限公司 72001 | 代理人： | 甘霖;李唐 |
| 地址： | 美国密*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 使用 成对 crispr 切口 核糖 核蛋白 修饰 免疫 相关 基因组 基因 | ||
1.一种用于修饰真核细胞中的免疫相关基因组基因座的方法，所述方法包括将包含一对引导RNA的成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）切口酶核糖核蛋白（RNP）引入真核细胞内，所述引导RNA设计为与所述免疫相关基因组基因座中的靶序列杂交，使得通过CRISPR切口酶RNP产生的双链断裂的修复导致所述免疫相关基因组基因座的修饰。
2.权利要求1的方法，其中所述引导RNA对的靶序列在所述免疫相关基因组基因座的相反链上。
3.权利要求1或2的方法，其中所述引导RNA对这样配置，使得与所述靶序列之一相邻的每个前间隔区邻近基序（PAM）序列面向外（或位于所述靶序列的远端）。
4.权利要求3的方法，其中所述PAM序列之间的距离是约35个碱基对至约120个碱基对。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述CRISPR切口酶RNP包括Cas9切口酶、Cpf1切口酶或Cas13a切口酶。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述CRISPR切口酶RNP包括Cas9切口酶。
7.权利要求6的方法，其中所述Cas9切口酶包括SpCas9切口酶、FnCas9切口酶、SaCas9切口酶、StCas9切口酶、SpaCas9切口酶、CjCas9切口酶、NmCas9切口酶或NcCas9切口酶。
8.权利要求6的方法，其中所述Cas9切口酶是SpCas9切口酶、FnCas9切口酶或SaCas9切口酶。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述Cas9切口酶是Cas9-D10A切口酶或Cas9-H840A切口酶。
10.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述Cas9切口酶是Cas9-D10A切口酶。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述CRISPR切口酶包含至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透结构域、至少一个标记物结构域、至少一个染色质破坏结构域或其组合。
12.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述CRISPR切口酶包含至少一个核定位信号。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为约2:1至约10:1。
14.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述真核细胞是人细胞或非人哺乳动物细胞。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述真核细胞是原代T细胞或T细胞群。
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