[发明专利]使用成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白修饰免疫相关基因组基因座

说明书

经改造为靶向免疫相关基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白，以及使用所述核糖核蛋白修饰免疫相关基因组基因座的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月13日提交的美国临时申请序列号62/657,488的优先权，所述美国临时申请的公开内容在此整体引入作为参考。

序列表

本申请含有序列表，其已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并且在此整体引入作为参考。于2019年4月10日创建的ASCII副本命名为P18_061_SL.txt，且大小为19,607字节。

领域

本公开内容涉及经改造为靶向免疫相关基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白，以及用于修饰免疫相关基因组基因座的方法。

背景

免疫疗法是强大的治疗选项，其利用免疫系统以对抗癌症、感染和其它疾病。传统的免疫疗法包括使用物质如疫苗、单克隆抗体、细胞因子等，以刺激或压制免疫系统和其它化合物。近年来，基因组编辑用于修饰细胞的DNA，以改造功能更好的细胞用于在免疫疗法中使用。锌指核酸酶和CRISPR核酸酶用于改造对抗疾病的细胞。然而，这些基因组靶向技术受低靶向频率和脱靶效应阻碍。因此，需要在免疫相关基因组基因座处改进和更精确的基因组编辑。

发明概述

在本公开内容的各个方面，提供了用于修饰真核细胞中的免疫相关基因组基因座的方法。该方法包括将包含一对引导RNA的成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）切口酶核糖核蛋白（RNP）引入真核细胞内，所述引导RNA设计为与免疫相关基因组基因座中的靶序列杂交，使得通过CRISPR切口酶RNP产生的双链断裂的修复导致免疫相关基因组基因座的修饰。

本公开内容的另一个方面涉及组合物，其包含CRISPR切口酶和经改造为靶向免疫相关基因组基因座的一对引导RNA。

本公开内容的另一个方面涉及治疗受试者中的癌症的方法。该方法包括根据本文所述的方法修饰离体真核细胞中的免疫相关基因组基因座，以制备修饰的真核细胞，并且将修饰的真核细胞递送给受试者。

其它目的和特点将是一定程度上显而易见的，而一定程度上在下文指出。

详述

本公开内容提供了经改造为靶向免疫相关基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白，以及使用所述成对的CRISPR切口酶RNP修饰免疫相关基因座的方法。本文公开的组合物和方法可以用于靶向免疫疗法，例如癌症免疫疗法。

（I）CRISPR切口酶核糖核蛋白

本公开内容的一个方面提供了靶向涉及免疫功能的基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核糖核蛋白（RNP）。成对的CRISPR切口酶RNP包含至少一对偏移引导RNA，其设计为与目标基因组基因座中的靶位点杂交，使得切口酶的协调切开导致基因组基因座中的双链断裂，当所述双链断裂通过细胞DNA修复过程修复时，导致对基因组基因座的修饰。

（a）靶基因组基因座

一般而言，成对的CRISPR切口酶RNP可以被改造为靶向免疫相关基因组基因座。基因组基因座可以例如与免疫细胞的效应子功能的丧失相关联，并且有利地与免疫细胞活化状态不同、分开或解开或独立。可替代地，基因组基因座可以例如与免疫细胞活化相关联，并且有利地与免疫细胞功能障碍状态不同、分开或解开或独立。因此，在各个实施方案中，例如，可以靶向功能障碍的基因座，同时使活化基因座完整。