[发明专利]通过两相流体系统的外来体分离方法

说明书

本发明为外来体分离方法，其能够从大量和少量样品和以前不能从其中获得外来体的样品类型中廉价地获得高纯度外来体。

发明领域

本发明为外来体分离方法，其能够从大量和少量样品和以前不能从其中获得外来体的样品类型中廉价地获得高纯度外来体。

发明背景

囊泡是参与物质在细胞内的运输和储存的小囊，并且通过至少一个脂质双层与细胞质流体分离。外来体是由许多生物体（从原核生物到高等真核生物和植物）释放的囊泡，并且其含有不同尺寸的脂质双层囊泡[1]。这些囊泡的重要性在于将信息传递至其它细胞以影响细胞功能的能力。通过外来体的信号传递通过由蛋白质、脂质、核酸和糖组成的许多不同类别的生物分子进行[2]。

在1982年，通过实验确定从精浆分离的囊泡增加精子运动性，首次发现了细胞外囊泡与细胞的功能相互作用[3]。从这一点开始，直到今天，已经在许多不同组织中进行了关于囊泡分子机制的开发的研究，并将留在黑暗中的问题暴露出来。

从骨髓组织获得的间充质干细胞的外来体已显示在作为心脏毒素肌损伤模型的C2C12成肌细胞系和C57BL/6小鼠中促进肌原性分化和血管生成，并从而诱导再生为骨骼肌[4]。从子宫内膜组织获得的间充质干细胞的外来体已显示在作为CCl₄诱导的肝损伤模型的TAMH和THLE-2肝细胞细胞系和C57BL/6小鼠中降低血清中的ALT和AST值，并增加能够使肝中细胞更新的基因的活性[5]。从经历细胞分化的PC-12细胞系分离的外来体已显示增加间充质干细胞(特别是miR-125b)的神经元蛋白和基因的表达，并且诱导间充质干细胞的神经原性分化[6]。从柠檬汁分离的外来体已显示在A549、SW480和LAMA84细胞系和NOD/SCID小鼠中在TRAIL途径上导致细胞凋亡，并且以高速率增加凋亡基因的激活。此外，使用超速离心，以600微克的极低产率从240 ml样品分离植物来源的外来体[7]。基于免疫磁性分离，使用包覆有HLA、DP、DQ、DR特异性单克隆抗体的磁珠，从抗原呈递细胞(APC)分离的外来体作为高纯度外来体获得[8]。使用聚合物沉淀作为分离尿外来体的新方法。发现它是比先前使用的方法更容易的方法，但是确定除了外来体之外还存在过量的污染物[9]。

现有技术中的应用可以用3个基本方法标题来陈述：基于超速离心的方法、基于过滤的方法、基于溶解度-沉淀的方法。

基于超速离心的方法：以100,000 g和更高的速度离心是当今最常用的外来体分离方法。除了是非常昂贵、费力和耗时的方法之外，它还以低效率分离外来体。这是因为基于超速离心的方法不具有任何选择性。由于它们沉淀出超过一定粒径的所有颗粒，它们还分离许多不需要的物质，例如蛋白质和脂蛋白，以及外来体。它在诊断病例(例如血液)中不是有效的，因为超速离心不能应用于低于50 ml的样品；而且也不能满足需要大规模生产时的要求。即使是指数增加处理时间的方法，例如梯度超速离心，也以比本申请的发明低得多的效率进行外来体分离。在专利文献号US6899863B1中公开的发明是该方法的一个实例。

基于过滤的方法：可以用根据外来体的尺寸制备的过滤器分离外来体。尽管用这些方法，可以更快地获得外来体，并且用比超速离心更便宜的装置，但是该方法不是优选的，因为施加在外来体上以穿过这些小的过滤器的力导致它们的结构劣化和分解。同时，外来体的尺寸是异质的(例如，植物外来体大于动物外来体)的事实使得难以将该方法应用于不同的外来体，并且还导致过滤器的频繁堵塞，从而降低过滤器的寿命，延长过程并减少获得的产物的量。研究人员优选过滤而不是超速离心的原因是速度和价格的优势。实例公布；(doi: 10.1152/ajprenal.00434.2006)。

基于溶解度-沉淀的方法：外来体可以在其溶解度低的溶液中沉淀而不需要超速离心。在这些方法中使用的聚合物(如聚乙二醇(PEG))保留水分子，并能够使具有较低溶解度的分子(包括外来体)沉淀。为了成功沉淀，必须将待分离的材料在PEG (或类似的聚合物)中于4℃下保持长达12小时。此外，除了外来体之外沉淀的其它材料降低终产物的纯度，并且当外来体从液相沉淀到固相时，与其它方法相比，外来体损失要多得多。