[发明专利]腺病毒纯化方法

说明书

本发明涉及病毒纯化方法。本发明提供了用于从细胞培养收获物中纯化腺病毒的下游方法。更确切地说，它涉及使用病毒捕获和病毒精处理步骤的腺病毒纯化方法。

发明领域

本发明涉及病毒纯化方法。本发明提供了用于从细胞培养收获物中纯化腺病毒的下游方法。更确切地说，它涉及使用病毒捕获和病毒精处理步骤的腺病毒纯化方法。

发明背景

人腺病毒已被分类为6个种类（A至F），具有55种已知的血清型，导致从幼儿中的轻度呼吸道感染（称为普通感冒）到具有减弱免疫系统的人中危及生命的多器官疾病的各种病。腺病毒是常见的病原体，其在实验上以及在已完成和正在进行的临床试验中广泛地用于肿瘤学、心血管学和再生医学中的基因递送以及用作疫苗载体。

腺病毒在各种传染病的许多临床前和临床研究中作为疫苗递送系统进行评估（Kallel，H.和Kamen，A.A. Large-scale adenovirus and poxvirus-vectored vaccinemanufacturing to enable clinical trials. Biotechnol J10，741–747（2015）。腺病毒还作为用于基因疗法的潜在病毒载体和作为溶瘤病毒进行探索。为了增强生产率并且生产更有效且更安全的疫苗，已开发了几代重组腺病毒载体（Appaiahgari，M.B.和Vrati，S.Adenoviruses as gene/vaccine delivery vectors: promises and pitfalls. Expert Opin Biol Ther15，337-351（2015）。研究最多的腺病毒载体是第一代重组腺病毒血清型5（AdV5），使其成为用于开发腺病毒生产方法的合适系统。

色谱技术用于腺病毒纯化，但就纯度、产率和容量而言，结果往往是不足的。

因此，仍然需要寻找用于腺病毒纯化的更好和更有效的方法，尤其是在病毒将用作腺病毒基因递送载体的那些情况下。

发明概述

本发明提供了具有高容量且高产率的用于腺病毒纯化的有效方法。

本发明涉及腺病毒纯化方法，其包括下述步骤：a）在阴离子交换树脂上从含腺病毒的细胞培养收获物中捕获腺病毒；b）用浅电导率梯度洗脱所述腺病毒，所述浅电导率梯度具有15-25%，优选18-20%的递增盐浓度；c）将所述洗脱的腺病毒加入包含多孔壳和多孔核的壳珠树脂中，其中所述核提供有疏水相互作用配体，而所述壳不提供有任何配体；并且d）从所述壳珠树脂洗脱所述腺病毒到流通物中，其中在步骤d）中洗脱的腺病毒包含小于1ng/ml的宿主细胞蛋白（HCP）。

优选地，盐是NaCl，并且梯度是递增的18-20%，并且盐浓度是0-700 mM，例如如下文实施例中的480-570 mM NaCl，或者在0-700 mM之间的任何区间，其对应于从起始盐浓度递增18-20%的浅梯度。

优选地，阴离子交换树脂是多元Capto Q ImpRes阴离子交换树脂，而壳珠树脂是Capto Core 700树脂。

将阴离子交换树脂装在柱中，并且将壳珠树脂装在另一个柱中，并且将洗脱的腺病毒以一定体积加入（装载到）壳珠树脂中，所述体积对应于包含壳珠树脂的柱的15-30个柱体积（CV），优选25-30 CV。核和壳的孔隙率可以相同或不同。

在步骤d）中洗脱的腺病毒是非常纯的，并且不包含可检测的杂质。宿主细胞蛋白（HCP）的水平是不可检测的或小于1 ng/ml。

如实验节段中所示，在步骤d）中洗脱的腺病毒的回收率为80-100%。

腺病毒的优选用途是作为用于细胞疗法的腺病毒载体。

附图简述