[发明专利]选择和监测治疗功效的指示物噬菌体及其使用方法

说明书

本文公开了用于检测样品中的微生物的方法和系统以及此类方法用于选择和监测疗法的应用。指示物噬菌体例如葡萄球菌属(Staphylococcus)特异性噬菌体的特异性允许检测特定微生物，例如葡萄球菌属，并且可以放大指示物信号以优化测定法灵敏度。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月24日提交的美国临时申请号62/661,739的优先权。美国申请号13/773,339、14/625,481、15/263,619和15/409,258以及美国临时申请62/661,739的公开内容在此通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于使用感染原检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒。

背景技术

对改善生物、食品、水和临床样品中的细菌、病毒和其他微生物的检测速度和灵敏度有强烈兴趣。微生物病原体可导致人类和家畜的大量发病，以及巨大的经济损失。此外，鉴于食用被某些微生物(例如，葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.))污染的食物而引起的危及生命或致命的疾病的爆发，对于食品和药物管理局(FDA)和疾病控制中心(CDC)而言，微生物的检测是高优先级的。

用于检测细菌的传统微生物测试依赖于非选择性和选择性富集培养物，随后在选择性培养基上铺板并进一步测试以确认可疑菌落。这样的程序可能需要几天。已经研究了多种快速方法并将其引入实践以减少时间要求。但是，这些方法具有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链反应(PCR)测试还包括扩增步骤，并因此能够具有很高的灵敏度和选择性；但是，可以经济地进行PCR测试的样品大小是有限的。使用稀释的细菌悬浮液，大部分小的子样品将没有细胞并因此仍然需要纯化和/或冗长的富集步骤。

传统生物富集所需的时间由样品的靶细菌群体的生长速率、样品基质的作用和所需的灵敏度决定。在实践中，大多数高灵敏度方法利用过夜孵育，并且整个过程耗费约24小时。由于培养所需的时间，这些方法可耗费多达三天，取决于要鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食物、水(或其他产品)可能已经进入牲畜或人类。此外，抗生素抗性细菌的增加和对生物防御的考虑使得全世界非常优先地考虑水、食品和临床样品中的细菌病原体的快速鉴定。

因此，需要更快速、简单和灵敏的检测和鉴定微生物，例如细菌、病毒和其他潜在致病的微生物。

发明内容

本发明的实施方案包括用于检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒。本发明可以以多种方式实施。

在一些方面，本发明包括重组噬菌体，其包含插入到噬菌体基因组的晚期基因区域中的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的葡萄球菌属特异性噬菌体基因组。在一些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)特异性噬菌体基因组。在进一步的实施方案中，金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林(methicillin)金黄色葡萄球菌(MRSA)。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的噬菌体基因组。在一些实施方案中，用于制备重组噬菌体的噬菌体特异性感染葡萄球菌属。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型的细菌的存在下区分葡萄球菌属。

在重组指示物噬菌体的一些实施方案中，可以对指示基因进行密码子优化并且可以编码生成内在信号的可溶性蛋白质产物或与底物反应时生成信号的可溶性酶。一些重组噬菌体还包括在密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，例如，Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者可以是遗传改造的基因，例如，NanoLuc。