[发明专利]用于产生心脏类器官的方法

权利要求书

1.一种体外产生心脏类器官的方法，包括

a)提供在第一培养基的悬浮液中培养的多能干细胞(PSC)，

b)在具有U形底部的第一容器中离心所述PSC，以使所述PSC位于所述第一容器的底部，

c)在细胞培养条件下，在所述第一培养基下温育所述位于所述第一容器底部的所述PSC，

d)任选地从位于所述第一容器底部的所述PSC中除去所述第一培养基，

e)将所述PSC包埋在水凝胶内，

f)温育包埋在所述水凝胶中的所述PSC以固化所述水凝胶，

g)用第二细胞培养基覆盖包埋在所述固化的水凝胶中的所述细胞，并在细胞培养条件下进行温育，

h)从所述细胞中去除所述第二培养基，并添加含有具有诱导WNT途径的活性的第一分化因子的第三细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少6小时，

i)从所述细胞中除去所述第三培养基，并添加不含分化因子或者含有中和所述第一分化因子活性的试剂的第四细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少6小时，

j)从所述细胞中除去所述培养基，并添加含有具有抑制WNT途径的活性的第二分化因子的第五细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少1天，

k)从所述细胞中除去所述第五培养基，并添加不含胰岛素且不含具有诱导或抑制WNT途径的活性的分化因子的第六培养基，并在细胞培养条件下温育至少1天，

l)从所述细胞中去除所述第六培养基，并添加含有胰岛素的第七细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少1天，

m)并且然后至少每2天将所述第七培养基换为新鲜细胞培养基。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤a)至m)中的温育在基本静态的条件下。

3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在步骤c)中，在细胞培养条件下在所述第一培养基中温育位于所述第一容器底部的所述PSC达46小时至50小时。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在步骤e)中，将水凝胶置于第二容器中，并将聚集的PSC从所述第一容器转移到所述水凝胶中，以将PSC的聚集物包埋在所述水凝胶内。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在步骤g)中，将包埋在所述固化的水凝胶中的所述PSC与第二细胞培养基一起温育约2天。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在步骤h)中，所述第一分化因子是CHIR99021。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在步骤j)中，所述第二分化因子是IWP-2。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于在以下步骤的至少一个中：步骤h)中所述第三培养基含有无胰岛素的B27补充剂，步骤i)中所述第四培养基含有无胰岛素的B27补充剂，步骤j)中所述第五培养基含有无胰岛素的B27补充剂，步骤k)中所述第六培养基含有无胰岛素的B27补充剂，和步骤1)中所述第七培养基含有无胰岛素的B27补充剂。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于在步骤h)后至少1天之后，将至少一种测试化合物添加到所述培养基中，并且在温育之后，分析所述类器官，并与不添加所述测试化合物并行处理的类器官进行比较。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于在步骤1)或m)之一之后溶解所述水凝胶。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，将测试化合物添加到所述方法的至少一种培养基中，并与在不添加所述测试化合物的情况下进行的并行方法中产生的心脏类器官相比分析所述心脏类器官。

12.根据权利要求11的方法，其中分析所述心脏类器官的细胞类型的结构和/或位置。