[发明专利]用于产生心脏类器官的方法

说明书

本发明提供了从培养的多能干细胞体外生产心脏类器官的方法，该心脏类器官可重复地具有特定心脏细胞层的结构。

本发明涉及使用多能干细胞(PSC)，优选人PSC体外产生心脏类器官的方法，涉及可通过该方法获得的心脏类器官，以及涉及通过以下方法分析测试化合物对心脏细胞活性的方法：在其生产过程中将PSC暴露于测试化合物和/或将至少一种可通过其生产方法获得的心脏类器官暴露于测试化合物，并分析类器官，例如与PSC和/或并行处理但不存在测试化合物的心脏类器官比较。

所述方法和心脏类器官的优点是可在培养的多能干细胞的基础上获得，并且优点是提供包含不同心脏细胞或由不同心脏细胞组成的邻接层，任选地包括非心脏细胞，这些层由纯体外方法培养，并提供了邻接的心脏组织层(任选地包括非心脏细胞)的体外模型。已经发现这些组织层结构良好并包含细胞类型，这些层和细胞类型是早期胚胎心脏的典型特征。心脏类器官可以保存在静态或搅拌(例如摇动)，的培养容器中的细胞培养基中，例如没有定向的流体流动，没有血液流动，并且自由地悬浮，即没有机械固定。

现有技术

已知培养心肌细胞以获得粘附在培养容器表面的这些细胞层。

已知商标Matrigel(Corning Life Sciences and BD Bioscience)命名了由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物。

Richards等人，Biomaterials 112-123(2017)描述了通过在琼脂糖模具中沉积心肌细胞、心脏心室成纤维细胞、脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人脂肪来源的微血管内皮细胞(HAMEC)以及人脂肪来源的干细胞(hADSC)，以首先产生球形微组织，然后将其组装成球状体来制造心脏类器官。

Elliott等(2011)“NKX2-5(eGFP/w)hESCs for isolation of human cardiacprogenitors and cardiomyocytes”,Nature methods 8(12),S.1037–1040.DOI:10.1038/nmeth.1740描述了hESC3 NKX2.5-eGFP细胞的产生。

US 2017/0198256 A1描述了将hiPSC培养和收获为单细胞或细胞团块，将其与液体可交联的PEG纤维蛋白原前体溶液组合以产生单个hiPSC或hiPSC团块在可交联溶液中的统计分布，所述可交联溶液以一定形式交联，得到宽度为6mm、厚度为200μm的圆柱体。在将这些圆柱体培养3天后，更换培养基以诱导hiPSC的分化，产生心肌细胞。

US 2016/0271183 A1描述了悬浮的人胚干细胞在含有基质胶(Matrigel)以及BMP4、Rho激酶抑制剂、激活素A和IWR-1的培养基中向心肌细胞的分化。

WO 2018/035574 A1描述了一种96孔培养板，在每个孔中具有两个间隔开的直立柱。心肌细胞成熟培养基中接种的祖细胞应形成附着在两个柱上的收缩组织。

Pashmforoush等人，Nkx2-5 Pathways and Congenital Heart Disease:Loss ofVentricular Myocyte Lineage Specification Leads to Progressive Cardiomyopathyand Complete Heart Block,Cell 2004,117,373–386描述了NKX2.5遗传缺陷的体内结构缺陷。