[发明专利]去免疫化的因子VIII分子以及包含其的药物组合物

说明书

本发明涉及治疗性蛋白领域，尤其涉及重组凝血因子。其提供了在限定位置包含特定点突变的重组因子VIII(FVIII)蛋白，所述特定点突变用于降低所述FVIII蛋白的免疫原性，其中所述因子VIII蛋白基本上保留了其凝血活性。其还提供了编码所述去免疫化的蛋白的核酸、细胞系和重组制备方法以及包含本发明的重组FVIII的药物组合物，其对于用于治疗甲型血友病患者(特别是尚未使用FVIII产品治疗过的患者)是有利的。另外，对于此前已治疗的患者，甚至对于已经对FVIII(例如，对于免疫耐受诱导疗法(ITI/ITT)或挽救ITI)产生免疫应答的患者，其均是安全的选择。本发明还提供了用于确定蛋白免疫原性的测定。

背景技术

本发明涉及治疗性蛋白领域，尤其涉及重组凝血因子。其提供了在限定位置包含特定点突变的重组因子VIII(FVIII)蛋白，所述特定点突变用于降低所述FVIII蛋白的免疫原性，其中所述因子VIII蛋白基本上保留了其凝血活性。其还提供了编码所述去免疫化的蛋白的核酸、细胞系和重组制备方法以及包含本发明的重组FVIII的药物组合物，其对于用于治疗甲型血友病患者(特别是尚未使用FVIII产品治疗过的患者)是有利的。另外，对于此前已治疗的患者，甚至对于已经对FVIII(例如，对于免疫耐受诱导疗法(ITI/ITT)或挽救ITI)产生免疫应答的患者，其均是安全的选择。本发明还提供了用于确定蛋白免疫原性的测定。

FVIII是凝血级联反应中的重要辅因子。野生型人FVIII是作为由2351个氨基酸组成的单链合成的，其包含被短酸性序列(a1-a3)截断的三个A结构域(A1-A3)、一个B结构域和两个C结构域(C1和C2)。前19个氨基酸是信号序列，该信号序列被细胞内蛋白酶切割，导致FVIII分子具有2332个氨基酸。所得到的结构域结构是A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2。在翻译后修饰期间，FVIII被糖基化、硫酸化和蛋白水解加工。整个FVIII蛋白含有25个潜在的N-糖基化位点。这些位点中的19个位于B结构域中，另外6个位点沿蛋白的其余部分分布。由于并非所有这些位点都被糖基化，因而FVIII仅具有21个N-糖基化。此外，B结构域含有7个O连接的糖基化。FVIII的糖基化在细胞内折叠和运输中起作用。硫酸化对于与不同蛋白，尤其是凝血酶和血管性血友病因子(vWF)的胞外相互作用非常重要。其发生在酸性区a1、a2和a3的六个酪氨酸上。丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶的细胞内切割将FVIII分成重链(A1-a1-A2-a2-B)和轻链(a3-A3-C1-C2)。在这一切割过程中，部分B结构域可能会丢失。因而，轻链的分子量为80kDa，而重链可能略有异质性，其分子量在210kDa左右。重链与轻链之间的结合不是共价的，而是由A1和A3域之间的二价金属离子Cu²⁺介导的。

在循环中，FVIII通过a3、C1和C2结构域与vWF结合，从而保护FVIII免于早期激活和降解。

激活后，FVIII在三个位置被凝血酶切割，导致产生异源三聚体和B结构域的丢失(异源三聚体FVIIIa)。异源三聚体与被激活的凝血因子IXa和凝血因子X形成复合物，并且轻链与磷脂双层结合，例如(被激活的)血小板的细胞膜。

甲型血友病主要是X染色体连锁的遗传性出血性疾病，在5000名新生男性中有1名发生。然而，由于针对FVIII的自身免疫应答，因而甲型血友病也可能自发发生。甲型血友病患者遭受更长的出血持续时间、自发性出血和内出血，影响其日常生活。

通常通过施用FVIII治疗甲型血友病患者。根据疾病的严重程度(轻度、中度或重度)，根据需要进行治疗或预防。治疗性FVIII产品是从人血浆中纯化的(pFVIII)，或者该产品是在细胞培养物中重组生产的(rFVIII)。

在开发用于治疗的重组FVIII分子的过程中，已经设计了B结构域缺失的FVIII分子，因为B结构域对于凝血中FVIII的功能并不重要。这主要导致尺寸减小。最常见的B结构域缺失的FVIII产品之一是辉瑞公司生产的ReFacto或ReFacto AF。这种FVIII变体缺乏B结构域的894个氨基酸。