[发明专利]用于重组蛋白的更高表达的前导序列

说明书

本发明涉及用于重组蛋白的更高表达的前导序列。本发明进一步涉及使用前导序列制备胰岛素和胰岛素类似物的方法。前导肽显著增加了前胰岛素原的表达。本发明还涉及通过将片段与本发明的前导序列融合而制备的蛋白序列。通过使用所述前导序列制备胰岛素及其类似物来证明本发明。

技术领域

本发明涉及用于表达重组蛋白的新型前导序列。本发明还涉及使用前导序列改进重组蛋白的表达的方法。

背景技术

背景技术说明包括可有助于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的本发明有关，或者明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。

重组DNA技术的应用已经使许多重组治疗蛋白可用于生物医药用途。原核和真核表达系统通常都用于重组蛋白的生产。

在所有表达系统中，大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)仍然是用于生产重组蛋白的最有利宿主，因为其蛋白生产更快、更廉价并且产量高。众所周知的遗传学和各种分子工具的可用性也极大地促进了大肠杆菌在生物医药工业中的应用。各种启动子、前导配偶体和突变菌株的可用性为大肠杆菌增加了巨大优势，使其成为实验室和工业水平上用于重组蛋白生产的最广泛使用的方法之一。

伴随许多优点，然而，由于缺乏进行翻译后修饰诸如糖基化和重折叠以便表现出活性的复杂机制，大肠杆菌在表达更复杂的蛋白上存在局限性。

另一方面，许多哺乳动物蛋白和其他蛋白不能在大肠杆菌中成功表达，其在大范围的其他生物体如杆状病毒(Baculovirus)表达系统、革兰阳性生物体、假单胞菌(Pseudomonas)表达系统中探索表达。大肠杆菌中更高的蛋白生产是重组蛋白生产过程中的主要瓶颈，并且已经进行了许多尝试以克服和解决这些问题。在一些情况下，研究人员探索了使用强启动子、向生长培养基中添加蔗糖和甜菜碱、使用具有磷酸盐缓冲液的丰富培养基以及使用前导序列以增加表达。除了较低的表达外，重组蛋白的蛋白水解降解是表达宿主中的主要问题。

获得蛋白的高产量的其他因素包括目标基因、表达载体、基因剂量、转录调控、密码子使用、翻译调控、宿主设计、生长培养基和可用于操纵目的蛋白的表达条件、比活性或生物学活性的培养条件或发酵条件、蛋白靶向、融合蛋白、分子伴侣(molecularchaperons)和蛋白降解。

N-或C-末端与前导序列的融合是提高表达蛋白的表达和稳定性的最佳方法之一。在转录的mRNA中形成强二级结构会降低异源基因的表达。强二级结构会干扰核糖体与mRNA的结合，从而阻止有效的翻译起始。在蛋白的N-和C-末端两处的前导序列决定子可以影响重组蛋白的表达和对蛋白酶降解的稳定性。

前导序列是用于蛋白表达的高效工具。除了表达外，前导序列还影响溶解性以及甚至其融合配偶体的折叠。它们允许纯化几乎任何蛋白，而无需其生物化学特性的任何先验知识。

US10000544描述了一种用于通过在宿主细胞中经由表达构建体表达胰岛素或胰岛素类似物来生产胰岛素或胰岛素类似物的方法。表达构建体在宿主细胞特别是在细菌细胞中具有用于胰岛素的前导肽。

US6841361描述了DNA用于由融合蛋白制备胰岛素的用途，其通过经由凝血酶和羧肽酶B的作用的DNA表达而获得。

JP-B-7-121226和JP2553326描述了用于在酵母中表达包括经由两个碱性氨基酸残基连接的B链和A链的小胰岛素原；并且然后在体外用胰蛋白酶处理该小胰岛素原，从而生产胰岛素的方法。

然而，没有一个前导序列就所有这些参数而言都是最优的；每个都有其优点和缺点。可以针对特定蛋白以不同组合将多个前导序列加在一起，以获得关于表达、溶解性和纯化的更好结果。因此，本领域需要提供有助于简单高效地有效表达重组胰岛素的前导序列。

发明目的