[发明专利]单细胞分析的微流控方法

说明书

本发明的第一个方面涉及在微流体系统中检测目标化合物的方法。本发明的第二个方面涉及根据第一个方面的方法的应用，用于监测生物事件。本发明的另一个方面涉及微流体系统及其应用，用于实施根据第一个方面的方法。

技术领域

本发明涉及细胞和分子生物学领域，并且基于用于检测在液滴中由单个细胞产生的目标化合物的方法。本发明还涉及微流体领域，并且包括微流体装置及微流体装置在进行生物学测定中的用途。

背景技术

在药物发现过程中，步骤之一与基于候选药物的预期生物学作用对候选药物进行验证有关。为此，可以使用体内或体外模型。一方面，体内实验具有解决整个生物体问题的优势。但是，动物模型并不一定能预测人类会发生什么。而且，体内研究是昂贵的，并且其使用受到伦理考虑的限制。另一方面，即使不能复制生物体的精确细胞状态，体外系统也可以对人细胞进行，并且特别适用于需要高通量的筛选过程。这些基于细胞的分析通常对目标细胞进行。但是，在某些情况下，如免疫细胞一样，它们中的每一个都是独特的，因此在单个细胞水平上基于功能性细胞的检测的需求引起了极大的兴趣。实际上，在大量人群中测量免疫应答会增加掩盖每个单个细胞独特行为或贡献的风险，尤其是在免疫应答高度异源或由稀有细胞种群驱动时。因此，需要基于单细胞的分析方法，以更好地了解考虑单个细胞表型的不同细胞之间的潜在差异。

单细胞分析方法的最新进展通过表征种群内细胞之间的关系，改善了单细胞内的生物学理解。因此，通过确定罕见的细胞事件或单个细胞之间的微小变化，有可能解决癌症、免疫学、传染病、干细胞以及发育生物学和神经病学领域尚未解决的问题。

免疫细胞通过产生抗体、趋化因子和细胞因子来保护宿主生物免受疾病侵害。前一类分子是先天性和适应性免疫细胞作为化学信使分泌的一组蛋白质。免疫细胞产生它们的原因是人体能够增强免疫反应，因此具有很高的临床诊断价值。因此，抗体和细胞因子分泌动力学的研究均可为疾病诊断和个性化治疗提供重要信息。

然而，缺乏用于分析单个分泌细胞的定量、单细胞、高通量系统限制了对免疫反应动力学的研究。

近来，基于液滴的微流体系统由于其在细胞生物学中的应用范围以及基于其在单细胞水平上控制机械、生物和流体环境的能力而引起了极大的兴趣。该技术使测定能够非常快速地进行(每秒多达数千个细胞和/或液滴)。此外，该系统还提供了大规模(微微升或纳升容积的样品和试剂)细胞培养实验，其中生物样品被限制在液滴中，从而可以快速检测高浓度的化合物(从pM到μM范围)。此外，该系统最大程度地减少了样品损失和交叉污染，却可以实现快速混合、热传递和化学反应。有趣的是，该技术提供了在单个细胞水平上进行大规模基因型和表型筛选的可能性。

在过去的几年中，已经提出了用于单细胞分析的不同微流体装置和系统(Gross等人2015，Int.J.Mol.Sci.16(8)：16897-16919；Reece等人2016，Curr.Opin.Biotechnol.40：90-96)。

已经提出了用于微流控中的细胞分选的不同方法和技术。分选原理主要分为两类：基于细胞的物理特性(例如大小、可变形性、电学特性或光学特性)的方法，以及基于生物分子特性(尤其是特定表面抗原)的方法。

使用与细胞成分结合的单克隆抗体可以实现高纯度的细胞分离和分选。广泛使用的基于抗体的细胞分析和/或分离技术包括细胞淘选、磁性细胞分选(MACS)和荧光活化的细胞分选(FACS)，包括荧光活化的液滴分选(FADS)。

在细胞淘选技术中，表现出特定抗原的细胞可以选择性地附着在抗体包被的表面上。尽管该技术可以提供高纯度，但仍受某些限制(例如高细胞损失或对细胞存活的影响)的影响。