[发明专利]CAR NK细胞

权利要求书

1.一种用于制造用嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的NK细胞的群体的方法，该方法包括：

(i)第一阶段：根据以下步骤产生含有CD34+细胞的中间体细胞群体，这些细胞携带编码CAR的至少一种多核苷酸：

a)获得选自由以下组成的组的生物起始样品：骨髓、外周血、胎盘或脐带血，

b)从此类生物样品分离造血干细胞，

c)在培养基I的存在下，培养分离的造血干细胞，

d)通过将培养的干细胞与携带编码CAR的至少一种多核苷酸的慢病毒载体一起孵育来转导此类细胞，从而获得含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体，以及

e)任选地，在培养基I中培养该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体至少一天，其中

培养基I是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含白介素-7，和干细胞因子(SCF)、flt-3配体(FLT-3L)、血小板生成素(TPO)中的一种或多种，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和白介素-6(IL-6)中的两种或更多种，

(ii)第二阶段，该第二阶段包括：

任选的预备步骤：在培养基II中进一步扩增来自该第一阶段的该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体，由此获得含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体，其中培养基II是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L白介素-15(IL-15)和IL-7中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF和IL6中的两种或更多种，以及

将来自阶段I的该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体、或来自该任选的预备步骤的该含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体扩增和分化成含有CAR-NK细胞的细胞群体的步骤，该步骤包括在培养基III中培养来自阶段I的含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体、或来自该任选的预备步骤的含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体，由此获得含有NK细胞的细胞群体，其中该培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种，

其中该嵌合抗原受体针对CD44v6。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该第二阶段包括预备扩增步骤、以及扩增和分化的步骤两者。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该生物样品是脐带血。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使用CD34+免疫磁性选择方法分离干细胞。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在培养基I中进行转导。

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中培养基I包括：浓度为4ng/ml至300ng/ml的SCF、或浓度为4ng/ml至300ng/ml的Flt3-L、或浓度为4ng/ml至100ng/ml的TPO、或浓度为4ng/ml至50ng/ml的IL7、或指定浓度范围的这些细胞因子的任何组合。

7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中产生该中间体细胞群体的阶段包括一个或多个转导运行。

8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中将CD34+干细胞与MOI为10至200的慢病毒载体一起孵育。

9.根据权利要求8所述的方法，其中将CD34+干细胞与MOI 100的慢病毒载体一起孵育。

10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该慢病毒载体携带编码用作免疫选择的标记的可选择蛋白质的另外的多核苷酸。

11.根据权利要求10所述的方法，该方法进一步包括使用免疫磁性选择方法选择CAR-CD34+干细胞的步骤。