[发明专利]油酸衍生物的选择性水合

说明书

本发明涉及通过经修饰的油酸水合酶的作用对包括油酸酯的油酸衍生物进行区域选择性和立体选择性水合。

本发明涉及通过经修饰的油酸水合酶的作用对包括油酸酯的油酸衍生物进行区域选择性和立体选择性水合。

脂肪酸水合酶(FAHY；EC 4.2.1.-)通过将水加成到游离的单不饱和或多不饱和脂肪酸的分离的碳-碳双键来催化中链和长链羟基脂肪酸的形成。因此，它们提供了仲醇和叔醇的取得方法，这使得它们成为了用于生产各种化学品(包括风味添加剂、化妆品、表面活性剂、润滑剂和聚合物化学品中的前体)的有价值工具。FAHY在合成中的使用有望带来与它们的出色的区域选择性和立体选择性有关的明显优势，所述区域选择性和立体选择性允许使用非选择性的酸催化化学水合不可能发生的反应。多数已知的FAHY在对不饱和脂肪酸的顺式-9或顺式-12双键进行水合中为高度区域选择性的。但尚没有关于通过任何已知的FAHY进行脂肪酸酯的水合的任何已知信息。

迄今为止，最充分表征的FAHY是来自脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)的油酸水合酶(OhyA，EC 4.2.1.53)。它催化油酸(OA)的区域选择性和立体选择性水合，从而在不需要辅因子再循环的情况下以至少98％的卓越对映体过量(enantiomeric excess,ee)产生(R)-10-羟基硬脂酸。

到目前为止，FAHY在工业环境中的适用性仍然受到限制，这可主要归因于其狭窄的底物范围：所有工作表明，羧基、顺式构型中的双键、羧酸根与顺式双键之间7个碳的最小距离和11个碳的最小脂肪酸链长度对于转换而言是必不可少的。迄今为止尚未有人描述在末端碳处的水合，因为在伯碳处形成部分正电荷将与所提出的反应机理相冲突。

因此，需要拓宽作为迄今为止所表征的最佳酶的FAHY，具体是是OhyA的底物谱，以便将它用作工业过程中的工具。然而，卓越的区域选择性和立体选择性不应受到影响。

令人惊讶地，我们现在发现OhyA对油酸衍生物的底物耐受性是由对位于活性侧空腔(底物结合区)中的某些氨基酸，即高度保守的氨基酸残基的修饰触发的(根据水合酶工程改造数据库HyED中的序列比对；参见表1)。

具体地，本发明涉及具有FAHY(EC 4.2.1.-)的活性，例如OhyA(EC 4.2.1.53)的活性的经修饰的酶，所述酶以至少98％的ee催化水合反应，其中所述经修饰的酶在与根据SEQID NO:1的多肽中的选自由265位、436位、438位、442位以及它们的组合组成的组的残基对应的位置处包含一个或多个氨基酸取代。

显示出OhyA活性的根据SEQ ID NO:1的多肽，包括由根据SEQ ID NO:2的多核苷酸编码的多肽，已从脑膜炎败血伊丽莎白菌中分离出来(序列来源于GenBank登录号ACT54545.1)。

已从不同来源，包括哺乳动物、酵母或植物、或细菌分离出了FAHY。如本文所用，与未修饰的酶相比，“经修饰的”酶，即经修饰的FAHY，特别是经修饰的OhyA，具有朝向油酸衍生物的区域选择性和立体选择性水合的优选活性和/或特异性。如本文所用，“未修饰的”FAHY，特别是未修饰的OhyA是指不携带如本文所定义的一个或多个氨基酸取代的相应酶，在本文中也称为野生型酶。

如本文所用，携带如本文所定义的经修饰的FAHY活性，特别是包含如本文所定义的一个或多个氨基酸取代的OhyA的宿主细胞被称为“经修饰的”宿主细胞。携带未修饰的酶活性，即编码野生型OhyA基因的相应宿主细胞被称为“未修饰的”宿主细胞。

在一个实施方式中，如本文所定义的经修饰的酶，特别是经修饰的OhyA活性，包含在与根据SEQ ID NO:1的多肽中的残基265对应的位置处的氨基酸取代，优选地由丙氨酸取代谷氨酰胺(Q265A)。优选地，具有经修饰的OhyA活性的酶源自脑膜炎败血伊丽莎白菌。所述突变可以与如本文所定义的1个、2个、3个或更多个突变组合。