[发明专利]成熟的气道类器官、其制备方法和用途

说明书

提供了用于产生2D和3D分化的气道类器官的方法、通过所述方法产生的2D和3D分化的气道类器官以及所述2D和3D分化的气道类器官的用途。

技术领域

本发明一般涉及气道类器官，特别是分化的气道类器官、制备和使用方法，特别是用于流感病毒研究。

发明背景

甲型流感病毒(IAV)可以感染多种禽类和哺乳动物物种(包括人类)，并且具有显著的进化和适应新宿主的能力(1)。IAV的片段化RNA基因组和低保真度的RNA聚合酶允许抗原移位和漂移，其推动了这种进化。因此，来自禽类和猪的新病毒可以越过物种屏障并感染人类，导致散发性感染、流行病以及甚至大流行(Klenk,Cell Host Microbe 15(6):653-654(2014)；To,et al.,Lancet 381(9881):1916-1925(2013))。尽管在病毒学和流行病学方面取得了巨大进展，但仍无法预测哪种IAV的亚型或毒株将引起下一次爆发。2013年以来，来自禽类的新型重配H7N9流感病毒已在中国引起人类感染的反复爆发(To,et al.,Lancet 381(9881):1916-1925(2013)),Chen,et al.,Lancet 381(9881):1916-1925(2013))。根据世界组织报告，截至2017年10月，报告有超过1500例实验室确诊的H7N9人感染病例，病死率高于35％。2009年，21世纪的首次流感大流行是由一种新型大流行H1N1(H1N1pdm)引起的，其起源于“经典的”猪H1N1病毒与人H3N2病毒、禽病毒和禽样猪病毒的多种重配(AVIT,et al.,N Engl J Med 360(25):2605-2615(2009))。虽然猪病毒仅偶发性地感染人类，但是这种新的猪源H1N1pdm病毒株可以建立持续的人际传播，并从那时起就作为一种季节性病毒株在全球传播。病毒糖蛋白血凝素(HA)的蛋白水解裂解对于IAV获得传染性至关重要，因为只有裂解的HA分子介导病毒和宿主细胞之间的膜融合，这是引发感染所需的过程。低致病性禽类IAV和人类IAV的HA蛋白在切割位点携带单个碱性氨基酸精氨酸(Bottcher E,et al.,J Virol 80(19):9896-9898(2006)；Bosch,et al.,Virology 113(2):725-735(1981))，被胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶识别。因此，这些病毒在人气道中的有效感染需要丝氨酸蛋白酶，如TMPRSS2、TMPRSS4、HAT等(Bottcher-Friebertshauser et al.,Pathog Dis 69(2):87-100(2013))。然而，高致病性禽类病毒(诸如H5N1)的HA蛋白含有被广泛表达的蛋白酶激活的多元切割位点。

目前用于研究人类呼吸道流感感染的体外模型涉及人肺外植体和原代气道上皮细胞的短期培养。在常规基础上人肺外植体不易获得。此外，在感染实验中原代组织的快速退化是主要问题。在气-液界面条件下，分离自人气道的基底细胞可极化并发生粘膜纤毛分化。然而，这种能力在2-3次传代后就丧失了(Butler,et al.,Am J Respir Crit Care Med194(2):156-168(2016))。总之，这些原代组织和细胞几乎不能构成研究人类呼吸道病原体的方便的、可再现的模型。尽管有各种细胞系(例如A549和MDCK)通常被用于繁殖流感病毒和研究病毒学，但它们很难再现人气道上皮的组织学。此外，由于丝氨酸蛋白酶活性低，除非培养基中补充了外源丝氨酸蛋白酶：经N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶，否则大多数细胞系不支持具有一元HA切割位点的流感病毒的生长。因此，为研究人类呼吸道的生物学和病理学，仍急需生物学相关的、可再现的和容易获得的体外模型。