[发明专利]用于产生视网膜色素上皮细胞的方法和组合物

权利要求书

1.用于获得视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，所述方法包括：

a.提供贴附在包含第一层粘连蛋白的第一基质上的人多能干细胞的培养物；

b.将所述干细胞暴露于分化培养基中约15天至约50天的第一时间段，以获得包含RPE细胞和/或其祖代的第一贴壁细胞群体；

c.在所述第一时间段结束时，将所述第一群体与所述第一基质解离；

d.将解离的第一细胞群体重新铺板在包含第二层粘连蛋白的第二基质上；以及

e.在所述第二基质上培养重新铺板的第一细胞群体第二时间段，以获得包含所述RPE细胞的扩增和成熟的第二细胞群体；

其中所述第一和第二层粘连蛋白独立地选自LN-521、LN-511、LN-111和LN-121，并且是完整的蛋白质或蛋白质片段。

2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二层粘连蛋白以约5μg/cm²至约20μg/cm²的量包被。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二基质不含异种物质(xeno-free)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二基质只含有单一类型的层粘连蛋白。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一层粘连蛋白是LN-111或LN-521，并且所述第二层粘连蛋白是LN-521。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一层粘连蛋白是LN-111，并且所述第二层粘连蛋白是LN-521。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一和第二层粘连蛋白均为LN-521。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞的培养物以约1.2×10⁴个细胞/cm²至约4.8×10⁴个细胞/cm²的细胞密度提供。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在暴露于分化培养基之前，所述多能干细胞在包含bFGF或TGFbeta的培养基中培养。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞在包含bFGF或TGFbeta的干细胞培养基中培养，并且在开始所述暴露于分化培养基之前的约12小时至约48小时的时间段内，Rho激酶抑制剂包括在所述干细胞培养基中。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分化培养基是缺乏将所述干细胞维持在多能状态的任何成分的干细胞培养基。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分化培养基缺乏bFGF和TGFbeta。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中激活素A包括在所述分化培养基中。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中激活素A以约50ng/ml至约200ng/ml的浓度包括在所述分化培养基中。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在不早于距所述暴露约4天至约8天的时间点，优选地在始于距所述暴露约5天至约7天并且终于所述解离步骤的时间的时间段内，最优选地在始于距所述暴露约6天并且终于所述解离步骤的时间的时间段内，激活素A包括在所述分化培养基中。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述时间段是约15天至约40天，优选地约15天至约33天，更优选地约18天至约30天，最优选地约18天至约22天。