[发明专利]用于产生视网膜色素上皮细胞的方法和组合物

说明书

方法包括提供贴附在包含第一层粘连蛋白的第一基质上的人多能干细胞的培养物；将干细胞暴露于分化培养基中15天至50天的第一时间段，以获得包含RPE细胞和/或其祖代的第一贴壁细胞群体；在第一时间段结束时，将第一群体与第一基质解离；将解离的第一细胞群体重新铺板在包含第二层粘连蛋白的第二基质上；以及在第二基质上培养重新铺板的第一细胞群体第二时间段，以获得包含RPE细胞的扩增和成熟的第二细胞群体。第一和第二层粘连蛋白可以独立地选自LN‑521、LN‑511、LN‑111和LN‑121，并且是完整的蛋白质或蛋白质片段。可用于体外生成RPE细胞的细胞表面标志物选自CD140b、CD56、CD104、CD164、CD220、EGFR、GD2、CD184、CD10、CD30、CD49a、CD49b、CD50、CD171、TRA‑1‑60和CD326，优选地CD140b、CD56、GD2和/或CD184。还包括如此产生的RPE细胞以及利用此类RPE细胞进行各种治疗的材料和组合物。

技术领域

本公开涉及从干细胞生成视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法和组合物。使用包被有层粘连蛋白的基质，以及特定的细胞培养基。还识别了可用于各种RPE体外生成应用(例如质量控制和富集)的细胞表面标志物。另外公开了利用本文所述方法和组合物生成的特定RPE细胞群体，以及利用其的各种治疗和其他过程。

发明背景

干细胞

干细胞是后续从中衍生出特化细胞的未分化细胞。干细胞转变为更加特化的细胞的过程称为分化。多能干细胞可以分化为三个胚层中的任何一个：内胚层、中胚层或外胚层。受精后，多能干细胞形成人体内的每种细胞类型，包括可塑性较低的干细胞群体，例如成年干细胞、胎儿干细胞和羊膜干细胞。胚胎干细胞是多能干细胞的一种，并具备大量自我更新能力和多能性。诱导的多能干细胞是通过称为体细胞重编程的过程从哺乳动物的终末分化细胞中生成的。

层粘连蛋白

层粘连蛋白是主要位于基底层中的异三聚体糖蛋白家族。它们通过在一侧上与邻近细胞受体的结合相互作用，以及通过与其他层粘连蛋白分子或其他基质蛋白例如胶原蛋白、巢蛋白或蛋白聚糖结合而发挥作用。层粘连蛋白分子也是重要的信号传导分子，其可以强烈影响细胞行为和功能。层粘连蛋白在维持细胞/组织表型，以及在组织修复和发育中促进细胞生长和分化方面都非常重要。

层粘连蛋白是具有共同结构组织的大型多结构域蛋白质。层粘连蛋白分子将各种基质和细胞相互作用功能整合到一个分子中。层粘连蛋白蛋白质分子包含一个α-链亚基、一个β-链亚基和一个γ-链亚基，这些亚基均通过卷曲螺旋结构域在三聚体中连接在一起。十二种已知的层粘连蛋白亚基链可在天然组织中形成至少15种三聚体层粘连蛋白类型。三聚体层粘连蛋白结构内是对其他层粘连蛋白和基底层分子以及膜结合受体具备结合活性的可识别结构域。例如，结构域VI、IVb和IVa形成球状结构，而结构域V、IIIb和Illa(含有富含半胱氨酸的EGF样元件)形成棒样结构。三条链的结构域I和II参与三链卷曲螺旋结构(长臂)的形成。

存在5条不同α链、3条β链和3条γ链，在人体组织中已发现它们的至少15种不同组合。根据其过往发现，这些分子被称为层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15，但是另一种命名法是基于它们的链组成来描述同种型，例如，含有α-1、β-1和γ-1链的层粘连蛋白111(层粘连蛋白-1)。现已识别四个在结构上定义的层粘连蛋白家族组。第一组五个鉴别的层粘连蛋白分子均共享β1和γ1链，并因其α链组成(α1至α5链)而异。第二组五个鉴别的层粘连蛋白分子(包括层粘连蛋白-521)均共享β2和γ1链，并且也因其α链组成而异。第三组鉴别的层粘连蛋白分子具有一个鉴别的成员层粘连蛋白-332，其链组成为α3β3γ2。第四组鉴别的层粘连蛋白分子具有一个鉴别的成员层粘连蛋白-213，其具有新鉴别的γ3链(α2β1γ3)。

视网膜色素上皮细胞