[发明专利]用于测序的引物寡核苷酸

说明书

多核苷酸测序方法采用了测序寡核苷酸，该测序寡核苷酸以比表面核苷酸更大的亲和力与模板多核苷酸链的游离3’末端部分杂交。可将此类测序寡核苷酸用作引物，通过利用模板链作为模板延伸测序寡核苷酸来确定索引序列的序列。采用此类测序寡核苷酸的测序过程提供了足够强的信号来确定索引序列的序列。

技术领域

本公开尤其涉及多核苷酸的测序。

背景技术

下一代测序(NGS)技术的改进极大地提高了测序速度和数据输出，导致现有测序平台巨大的样品通量。实现这种增加容量的一方面是多路复用，它会在文库制备过程中向待测序的各个多核苷酸片段添加独特的序列(被称为索引)。这允许在单次测序运行中同时合并和测序大量文库。由多路复用带来的通量增加会添加一层复杂性，因为在最终数据分析之前，需要在被称为多路分解的过程中识别并计算排序来自合并文库中的测序读段。

可将文库特异性索引序列添加至各文库的多核苷酸片段，从而可正确地鉴定各个被测序的多核苷酸片段的来源。在一些情况下，可将不止一个索引序列添加到给定的多核苷酸片段，以增加由索引序列提供信息的能力。例如，可将第一索引序列添加在包含片段的多核苷酸链的5’末端附近，并且可将第二索引序列添加在包含片段的多核苷酸链的3’末端附近。通过例如将包含索引序列的衔接子连接至待测序的多核苷酸片段的末端，可将索引序列添加至文库的多核苷酸片段。

衔接子还可包含除索引序列之外的序列，例如通用延伸引物序列和通用测序引物序列。通用延伸引物序列尤其可与偶联至固体表面的第一寡核苷酸杂交。第一寡核苷酸可具有游离的3’末端，聚合酶可利用杂交的文库多核苷酸作为模板从其添加核苷酸来延伸序列，导致文库多核苷酸的反向链与固体表面偶联。正向链和反向链的其他拷贝可通过簇扩增偶联至固体表面。簇扩增的一个实例是桥式扩增，其中结合至固体表面的先前扩增的多核苷酸的3’末端与结合至固体表面的第二寡核苷酸杂交。第二寡核苷酸可具有游离的3’末端，聚合酶可利用偶联的反向链多核苷酸作为模板从其添加核苷酸来延伸序列，导致文库多核苷酸的正向链经由第二寡核苷酸与固体表面偶联。可以重复该过程以产生偶联至固体表面的正向和反向链的簇。在测序之前，可将正向链或反向链例如通过切割去除。

测序引物可与偶联至固体支持物的多核苷酸链的一部分(被称为“模板链”)杂交。例如，如果存在的话，测序引物可与模板链的通用测序引物序列杂交。可通过利用模板链作为模板向测序引物多轮添加核苷酸并检测所添加核苷酸的身份来进行测序。测序引物的杂交可发生在模板链的某个位置，以允许索引序列以及模板链的靶序列的序列鉴定，或者可采用单独的测序引物分别测序索引序列和靶序列。因此，基于与靶序列相关的索引序列，可将靶序列索引到特定的来源文库。

在一些情况下，靶序列可能比可以可靠执行的测序循环数更长。在这种情况下，可将偶联至固体支持物的多核苷酸链的游离3’末端与具有游离3’末端的表面寡核苷酸杂交，利用偶联至固体支持物的多核苷酸链作为模板，可通过添加核苷酸来延伸表面寡核苷酸，以在被称为“配对末端转向(paired end turn)”的过程中形成拷贝链。可将模板链从固体表面切割并洗去，留下结合至固体表面的拷贝链。可在拷贝链进行靶序列的第二测序读取，以从靶序列相对于第一测序读取的相对末端获得序列信息。

如果模板链包含靶序列5’的第一索引序列和靶序列3’的第二索引序列，则在配对末端转向之后或在配对末端转向之前，通常利用配对末端转向中采用的表面引物来测序第二索引序列。两种情况都有缺点。例如，与从游离引物读取序列相比，从结合至固体表面的引物读取第二索引序列倾向于产生更高的噪音。在不需要或不期望进行第二读取的情况下，在配对末端转向之后读段索引序列将无法进行有效的多路分解。

发明概述

尝试利用包含与在配对末端转向中使用的表面引物相同的序列的游离引物来测序第一索引引物是不成功的。如本文所述，此类游离引物未产生足够强的信号以可靠地确定第二索引序列。尽管不希望受到理论的束缚，但据信表面引物与游离引物充分竞争以杂交模板链的3’末端，使得在利用游离引物测序第二索引期间获得的信号不足。