[发明专利]降低测序期间用未标记的核苷酸的定相

权利要求书

1.多核苷酸测序方法，其包括：

(a)将第一链延伸酶和封闭的、标记的核苷酸的混合物引入到包含位点的流动池，在所述位点处多条具有相同核苷酸序列的模板多核苷酸链与所述流动池的表面结合，其中所述第一链延伸酶配置为基于与拷贝多核苷酸链相对应的所述模板链的序列将所述封闭的、标记的核苷酸中的合适的一个核苷酸掺入所述拷贝多核苷酸链中；

(b)将未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去；

(c)在所述将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去期间或之后，将包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物引入到所述流动池，其中所述封闭的、未标记核苷酸的混合物的封闭的、未标记的核苷酸可用于基于与所述拷贝多核苷酸链相对应的所述模板链的序列掺入所述拷贝多核苷酸链中，条件是如果有的话，所述拷贝链中先前掺入的核苷酸未被封闭；和

(d)在将所述封闭的、未标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育时，如果有的话，检测掺入所述拷贝链中的一个封闭的、标记的核苷酸的身份。

2.根据权利要求1的方法，其中在所述将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之后，将所述包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物引入到所述流动池。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去包括将所述包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物引入到所述流动池。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中当检测掺入所述拷贝链中的所述第一封闭的、标记的核苷酸的身份时，所述封闭的、未标记的核苷酸的混合物的所述封闭的、未标记的核苷酸可用于掺入所述拷贝多核苷酸链中。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中检测掺入所述拷贝链中的第一封闭的、标记的核苷酸的身份包括对所述流动池进行成像。

6.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述检测掺入所述拷贝链中的第一封闭的、标记的核苷酸的身份发生在120秒或更少的时间段内。

7.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述检测掺入所述拷贝链中的第一封闭的、标记的核苷酸的身份发生在10秒或更多的时间段内。

8.根据权利要求1至7中的任一项的方法，其进一步包括：

(e)从掺入所述拷贝链中的任何第一标记的、封闭的核苷酸去除标记物和封闭部分，并从掺入所述拷贝链中的任何第二封闭的、未标记的核苷酸去除封闭部分。

9.根据权利要求8的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(d)。

10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中在将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之前，将所述第一链延伸酶和所述封闭的、标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育15秒或更少。

11.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中在将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之前，将所述第一链延伸酶和所述封闭的、标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育10秒或更少。

12.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中在将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之前，将所述第一链延伸酶和所述封闭的、标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育7.5秒或更少。

13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物包含第二链延伸酶，所述第二链延伸酶配置为基于与所述拷贝多核苷酸链相对应的所述模板链的序列将所述封闭的、未标记的核苷酸中的合适的一个核苷酸掺入所述拷贝多核苷酸链中，条件是如果有的话，所述拷贝链中先前掺入的核苷酸未被封闭。