[发明专利]降低测序期间用未标记的核苷酸的定相

说明书

多核苷酸测序方法包括当检测先前添加的标记的核苷酸的身份时，将未标记的核苷酸与具有相同序列的模板多核苷酸链的簇一起温育。检测步骤为添加待掺入拷贝链中的未标记的核苷酸提供了时间，在该拷贝链中先前添加的标记的核苷酸未得以掺入。因此，在检测步骤结束时，所有或大部分拷贝链将处于同相，并准备在随后的掺入步骤中掺入适当的标记的核苷酸。

技术领域

本公开尤其涉及多核苷酸的测序。

背景技术

模板多核苷酸链的测序可以通过多个循环的反应进行，借此每循环将一个可检测的核苷酸掺入拷贝链中。可检测的核苷酸通常被封闭以防止每循环掺入超过一个可检测的核苷酸。在温育时间之后，通常进行洗涤步骤以去除任何未掺入的可检测的核苷酸。然后可以进行检测步骤，其中确定掺入拷贝链中的可检测的核苷酸的身份。接下来，进行解封闭步骤和切割或掩蔽步骤，其中从拷贝链中最后掺入的核苷酸去除封闭剂，并从最后掺入拷贝链中的核苷酸切割可检测的部分或者在其上进行掩蔽。在一些情况下，可检测的部分充当封闭剂，且可检测的部分的去除可以去除封闭剂。然后通过在掺入步骤中引入可检测的核苷酸来重复该循环。

在许多情况下，具有相同序列的模板多核苷酸链的簇同时进行测序。簇用于放大由掺入拷贝链中的可检测的核苷酸所产生的信号。由于簇含有多条相同序列的模板链，所以在每一轮核苷酸添加时掺入相应拷贝链中的核苷酸应该是相同的，且可检测核苷酸的信号应该与簇中模板链的拷贝数成比例地增强。

多核苷酸测序的一个近期目标是在保持高保真度的同时减少完成测序的时间。实现减少测序时间的一种方法是通过缩短掺入步骤的持续时间来减少循环时间。一些更有效率的聚合酶和修饰的核苷酸已经被开发出来，以提供更有效率的核苷酸掺入拷贝链中。然而，掺入步骤仍然倾向于在经测序的所有模板链上经历核苷酸的不完全掺入。

当在掺入步骤期间核苷酸未掺入含有多条具有相同序列的模板链的簇中的拷贝链中时，其中未掺入核苷酸的拷贝链被称为与在掺入步骤期间其中掺入核苷酸的那些拷贝链异相(out of phase)。当异相的拷贝链的数量随着进一步的循环而增加时，来自簇的信号可能变得太不均匀，从而无法确定掺入同相(in-phase)拷贝链中的核苷酸。

发明内容

本公开尤其描述了多核苷酸测序方法，该方法在减少定相的同时允许掺入标记的核苷酸的短循环时间。方法包括当检测先前添加的标记的核苷酸的身份时，将未标记的核苷酸与具有相同序列的模板多核苷酸链的簇一起温育。检测步骤为添加待掺入拷贝链中的未标记的核苷酸提供了时间，在该拷贝链中先前添加的标记的核苷酸未得以掺入。因此，在检测步骤结束时，所有或大部分拷贝链将处于同相，并准备在随后的掺入步骤中掺入适当的标记的核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸测序方法包括将链延伸酶和封闭的、标记的核苷酸的混合物引入到流动池(flow cell)，该流动池包含位点，在该位点处多条具有相同核苷酸序列的模板多核苷酸链与该流动池的表面结合。基于与拷贝多核苷酸链相对应的模板链的序列，将链延伸酶配置为将适当的封闭的、标记的核苷酸中的一个掺入拷贝多核苷酸链中。方法进一步包括将未掺入的封闭的、标记的核苷酸从流动池洗去，并在将未掺入的封闭的、标记的核苷酸从流动池洗去期间或之后，将包含封闭的、标记的核苷酸的混合物的组合物引入流动池。基于与拷贝多核苷酸链相对应的模板链的序列，封闭的、未标记的核苷酸的混合物的一个封闭的、未标记的核苷酸可用于掺入拷贝多核苷酸链中，条件是拷贝链中先前掺入的核苷酸(如果有的话)未被封闭。方法还包括检测掺入拷贝链中的一个封闭的、标记的核苷酸(如果有的话)的身份，同时将封闭的、未标记的核苷酸的混合物与流动池一起温育。

然后，可以从掺入拷贝链中的封闭的、标记的核苷酸去除标记物和封闭物，并可从掺入拷贝链中的封闭的、未标记的核苷酸(如果有的话)去除封闭物。然后，可以将该过程重复进行预定循环数或直到测序完成。

一个或多个实施方案的细节在附图和以下说明书中阐述。其他特征、目的和优点根据说明书和附图以及根据权利要求书将是显而易见的。