[发明专利]基于逆转录转座子的递送媒介物及其使用方法

说明书

本公开提供了一种基因递送系统，所述基因递送系统包含：a)R2逆转录转座子R2多肽，或包含编码所述R2多肽的核苷酸序列的第一核酸；以及b)核酸，所述核酸包含编码一种或多种异源基因产物的异源核苷酸序列，其中所述异源核苷酸序列由R2逆转录转座子3’非翻译区(UTR)和R2逆转录转座子5’UTR侧接，并且其中所述异源核苷酸序列具有至少200个核苷酸的长度。本公开提供了一种将一种或多种目标基因产物递送至真核细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与所述基因递送媒介物系统接触。

交叉引用

本申请要求2018年7月13日提交的美国临时专利申请号62/697,829的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

引言

基因疗法正在成为治疗人疾病的越来越成功的技术。基因疗法涉及递送核酸，所述核酸包含编码目标基因产物的编码区，其中所述基因产物可提供功能性获得或功能性丧失，以校正特定细胞中的异常行为。递送通常分为两个主要类别：病毒介导的和非病毒介导的递送。另外，核酸的递送产生所述核酸的全部或一部分的瞬时表达或不可逆整合至宿主细胞的DNA中。病毒介导的整合方法最常用于分裂细胞，其中例如通过使用经工程化以将治疗性DNA携带至细胞中的慢病毒和逆转录病毒来介导递送。此类病毒可有效地稳定整合到宿主细胞的基因组中；然而，它们具有许多缺点。整合到细胞基因组中的随机位置可导致细胞功能的破坏，并且表达甚至可能最终因细胞自身的机制而沉默。此外，当待递送的编码区的大小对于逆转录病毒和慢病毒而言分别超过6千碱基(kb)或8kb时，病毒方法在它们的包装和递送编码目标基因产物的编码区的能力方面遭受严重损害。尽管许多基因疗法涉及在包装限制内的编码区域，但基因产物的编码区的长度已接近8kb的最大限制，并且添加更大的cDNA、调控元件或多个基因将使插入片段大小达到大于当前病毒递送媒介物所能够容纳的大小。

诸如piggyBac、睡美人(Sleeping Beauty)和Tol2的II类转座子可整合更大的有效负载；然而，此类转座子具有缺点。例如，DNA转座子可整合在基因组中特定但常见的位点处(值得注意的是，可转座元件通常占基因组的45％)，并且一些倾向于整合在发生活性转录的区域中。

在本领域中需要较大编码区的递送的递送媒介物。

发明内容

本公开提供了一种基因递送系统，所述基因递送系统包含：a)第一核酸，所述第一核酸包含编码R2逆转录转座子R2多肽的核苷酸序列；以及b)第二核酸，所述第二核酸包含编码一种或多种异源基因产物的异源核苷酸序列，其中所述异源核苷酸序列由R2逆转录转座子3’非翻译区(UTR)和R2逆转录转座子5’UTR侧接，并且其中所述异源核苷酸序列具有多达约15千碱基的长度。本公开提供了一种将一种或多种目标基因产物递送至真核细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与所述基因递送媒介物系统接触。

附图说明

图1A-1B描绘：(图1A)双载体整合系统的示意图，所述双载体整合系统编码由R2UTR靶向序列侧接的转基因；以及(图1B)所提出的R2整合机制的机制。

图2描绘使用本公开的基因递送系统递送的基因的28S rDNA中的基因组整合接点的分析。

图3描绘使用本公开的基因递送系统递送的基因的28S rDNA中的基因组整合接点的分析。

图4描绘用于细胞转染和传代的方案，并且呈现示出用本公开的基因递送系统转染后绿色荧光蛋白(GFP)表达的数据。

图5A和5B描绘优化的R2(“OR2”)对转基因表达的影响。

图6A和6B描绘在用本公开的基因递送系统转染细胞后嵌合抗原受体(CAR)的表达，其中异源核酸包含编码CAR的核苷酸序列。

图7提供R2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。

图8提供5’UTR的核苷酸序列(SEQ ID NO:38)。