[发明专利]用于进行定量实时PCR的反应混合物、方法和试剂盒

权利要求书

1.反应混合物，其提供用于进行定量实时PCR的反应批次以定量至少一种DNA片段（20；30；90），其特征在于，所述反应混合物包含

-至少一种靶DNA（11；21），其至少部分与待定量的DNA片段（20；30；90）对应，和

-至少一种参比DNA（12；22），其具有特定的序列和特定的量，和

-至少两种具有不同序列的不同荧光探针，它们在不同波长下生成信号，和

-引物和脱氧核苷酸和DNA聚合酶，

并且其中，靶DNA（11；21）和参比DNA（12；22）具有相同的引物结合位点（13、14；23、24）和不同的探针结合位点（17、18；27、28），并且其中，所述荧光探针的至少一种被设置用于与引物结合位点（13、14；23、24）之外的靶DNA片段（17；27）结合并且所述荧光探针的至少一种被设置用于与引物结合位点（13、14；23、24）之外的参比DNA片段（18；28）结合。

2.根据权利要求1所述的反应混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）的GC含量和参比DNA（12；22）的GC含量以至多15％的偏差是相同的。

3.根据权利要求1或权利要求23所述的反应混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）和参比DNA（12；22）的碱基对长度以至多15％的偏差是相同的。

4.根据前述权利要求中任一项所述的反应混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）和/或参比DNA（12；22）和/或引物和/或脱氧核苷酸和/或DNA聚合酶以冻干形式被提供。

5.根据前述权利要求中任一项所述的反应混合物，其特征在于，参比DNA（12；22）的量以与待定量的DNA片段（20；30；90）的检测极限对应的浓度存在。

6.根据前述权利要求中任一项所述的反应混合物，其特征在于，所述方法被设置用于检测和任选地定量来自基因组的DNA片段（20），其中，靶DNA（11）和参比DNA（12）以1:1的比率以特定的量包含在所述反应批次中。

7.用于进行定量实时PCR的方法，其特征在于，使用至少一种根据权利要求1至6中任一项所述的反应混合物进行PCR过程，并且其中，添加具有待定量的DNA片段（20）的样品，并且其中，检测所述至少两种荧光探针的荧光信号。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，由所述荧光探针的信号的比率来确定测试结果。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法在具有多个阵列容器的PCR阵列（500）中进行。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于具有预扩增（100）和至少一个随后的检测反应（102）的嵌套式PCR过程，其中，所述预扩增（100）的PCR产物量通过所述定量来估计。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，第一引物对用于预扩增（100），并且至少一种第二引物对用于检测反应（102），其中，靶DNA（21）和参比DNA（22）分别具有与引物序列互补的序列片段（23、24、43、44），并且其中，与第二引物对互补的序列片段（43、44）位于与第一引物对互补的序列片段（23、24）之间的片段内。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其特征在于，所述嵌套式PCR过程用于点突变检测，其中，突变敏感性引物和/或突变敏感性荧光探针用于所述检测反应。