[发明专利]用有限体积阵列进行样品细胞表型评估的组合物和方法在审

专利信息
申请号: 201980053262.5 申请日: 2019-06-13
公开(公告)号: CN112840203A 公开(公告)日: 2021-05-25
发明(设计)人: 马修·费舍尔;尼古拉斯·阿拉伯;罗丝·约翰逊;大卫·布西安 申请(专利权)人: 派特恩生物技术有限公司
主分类号: G01N21/64 分类号: G01N21/64;G01N33/50;G06N3/02;G06N3/08;G16C20/70;G16H10/40
代理公司: 北京柏杉松知识产权代理事务所(普通合伙) 11413 代理人: 邱俊霞;王春伟
地址: 美国德*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 有限 体积 阵列 进行 样品 细胞 表型 评估 组合 方法
【说明书】:

本发明的特定实施方案涉及通过记录和解释时间依赖性信号来评估和识别细胞,所述时间依赖性信号由分离的活细胞的独特细胞呼吸和渗透性属性产生。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月13日提交的美国临时专利申请序列第62/684736号和2018年10月18日提交的第62/747309号,每一个都通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开一般涉及细胞生物学和微生物学,更具体地涉及用于快速且灵敏地进行细胞表型评估的组合物和方法,以及它们对化合物和/或治疗的表型响应的快速且灵敏的表征。

背景技术

在各种情况下,发现致病细胞(DCC)的量低于常规分析技术的检测限。因此,根据应用,用于识别DCC和表征它们对治疗的响应的方法通常需要靶细胞的增殖和/或靶细胞的分子内容物和/或产物的靶依赖性扩增。

与其他技术相比,由于具有高灵敏度,核酸扩增(例如,基于PCR)测试(NAT)已成为快速病原体识别的优选方法。使用PCR可在数小时内将DNA从单拷贝扩增至数十亿拷贝。

NAT需要复杂的样品工作流程步骤,其通常包括细胞裂解,然后是核酸浓缩步骤,该步骤也从样品中去除PCR抑制剂。细胞裂解造成在核酸提取效率要求的不对称性。例如,与革兰氏阴性细菌相比,分枝杆菌和真菌具有非常厚的细胞壁,因此更难溶解,通常需要机械裂解步骤以有效破坏它们的细胞壁。因此,利用简单化学裂解方法的NAT通常对这些更棘手的病原体缺乏敏感性。此外,细胞裂解试剂可以抑制PCR反应,因为试剂使蛋白质变性,并且PCR利用蛋白质进行扩增反应。因此,细胞裂解需要引入高效洗涤步骤以从提取的核酸中去除裂解试剂。此外,NAT需要昂贵的分析开发方法,因为它们依赖于必须对每个靶特别设计的病原体特异性报告分子(引物和探针)。因此,每个NAT必须包括昂贵的分子研发过程,其涉及引物/探针设计和每个靶的筛选。

包含两个或多于两个靶的NAT(多重)无法准确并精确地同时量化这些靶。这是因为报告分子种类之间相同的非特异性相互作用引起PCR信号输出的变化,并且定量PCR依赖于可重复的反应结果,以将产生的扩增曲线与初始目标浓度相关联。这是明显的限制,因为它限制了使用多重NAT诊断产生大部分感染的身体非无菌感染区域的感染。在身体非无菌区域,人们通常被可以引起感染的相同病原体定植。因为感染是由压垮身体防御的微生物引起的,所以它们将通常产生比共生菌更多的菌落分离株。因此,在非无菌感染位点,临床样品中存在的病原体的数量(病原体负荷)决定细菌种类是引起感染还是“平静地”定殖于该位点。例如,为了明确诊断来自下呼吸系统(例如支气管肺泡灌洗液(BAL))的肺炎感染源,样品中存在的任何细菌的病原体负荷必须超过103CFU/mL才能被认为是感染源。类似地,对于尿液样品,阈值为105CFU/mL。

此外,如果NAT测定包括多于一种目标(多重测定),需要多于一种报告分子种类(引物和/或探针对),则不同的靶和/或报告分子种类可以与彼此非特异性相互作用,当报告分子非特异性地对抗其他试剂扩增时,导致假阳性,或当靶扩增反应被与另一种类的非特异性相互作用抑制时,导致假阴性。因此,这限制了在单个NAT内可以识别的靶的数量。这与耐药性问题特别相关,因为在革兰氏阴性细菌和分枝杆菌的情况下,存在许多指示耐药性的突变(每个突变是靶)。NAT只能在一次测试中检测这些突变的一小部分。此外,存在于生物体基因型中的基因可能并不总是呈现表型。因此,基因型信息通常描绘了病原体表型响应的不准确或不完整的图像。例如,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通常不表达赋予耐药性的mecA基因。因此,当涉及引起感染的病原体是否对特定药物敏感的临床重要确定时,NAT的临床有效性低,因为这些测试只能检测能够带来抗菌剂耐药性的小部分基因突变并且根本不能解释表观遗传耐药性机制。

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