[发明专利]原位基因编辑

说明书

公开了使用通过病毒(例如，AAV)递送的靶向序列的核酸酶对细胞(例如，干细胞、组织干细胞、肌肉干细胞、骨骼肌中的Sca‑1^*间充质祖细胞、CD140a^*真皮间充质细胞)进行原位基因组修饰的方法。

相关应用

本申请要求2018年8月18日提交的美国临时申请号62/719,628的权益。以上申请的全部教导内容以引用方式并入本文。

政府支持

本发明是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号F32AG050395、R01 HL135287、DP1 AG048917和R01 AR070825在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

背景技术

身体组织和器官的有效功能发挥取决于适当细胞数目的维持(体内稳态)和损伤后受损细胞的更换(修复)，这两个过程都需要组织干细胞的调控作用。跨越数十年的许多研究试图定义干细胞功能的关键分子调节剂。但是，研究人员能够询问和确定此类介体的速度因产生基因工程化小鼠和通常用于此类研究的干细胞移植模型的技术限制而受约束。特别地，转基因和基于基因敲除的方法需要产生和繁育多个不同的基因工程化缺失和/或夹杂等位基因(floxed allele)，以便以普遍或组织特异性方式破坏目标基因，当干扰若干基因的组合效应引人关注时，这一挑战就会加剧。同样，对干细胞的离体基因组操纵也需要对这些细胞进行分离和移植，这扰乱了内源性干细胞生态位中存在的关键调控相互作用，并会深刻地改变正常干细胞的特性(Wagers,2012)。因此，可编程的体内平台可操纵内源性干细胞中的基因表达而无需对这些细胞进行分离或产生复杂的多等位基因转基因动物，本领域将从中大大受益。

当前提出的许多基于CRISPR/cas9的基因修饰治疗方式包括离体方法，其中在修饰之前从患者移除靶细胞群。然而，实体组织不一定能从患者移除，进而限制了这些方法的适用性。此外，移除诸如造血细胞的组织会带来巨大的移植失败和感染风险，并且需要昂贵的GMP设施来处理离体细胞。由于细胞天然生态位和调控相互作用的丧失，组织移除还会破坏组织中的细胞功能发挥。因此，仍然需要原位基因修饰方法，特别是对于不能轻易从受试者体内移除的细胞。

发明内容

公开了一种强大的新平台，所述新平台可在细胞的生理生态位内遗传改变细胞，同时保留其天然干细胞特性和调控相互作用。特别地，所述系统允许原位操纵干细胞基因组，而无需进行细胞分离、培养或后续移植，从而保留了天然的调控相互作用和现有的干细胞特性。这种系统还减轻了与离体干细胞修饰和后续移植相关的挑战和毒性，例如体外条件无法维持稳健的干细胞功能，必需使用去髓性预处理，以及移植失败风险不可避免(Morgan等人,2017)。因此，利用DNA修饰酶直接转导内源性组织干细胞的机会与当前正在进行的旨在于干细胞中进行治疗性基因编辑的学术和商业努力有着直接和特定的联系，至此，所有这些都已被考虑在内，有必要纯化干细胞以进行离体修饰和再输注(Morgan等人,2017)。

本文所述的基于AAV的体内系统还克服了与当前用于询问干细胞功能的实验系统相关的关键技术和实践限制。特别地，常用的基于转基因和基因敲除的模型经常需要复杂的繁育方案来引入多个等位基因，这需要大量的时间和资源投入，且当评定老年动物中、非标准遗传背景下或组合方式的基因靶向效果时，变得更成问题。相比之下，如本文所公开，AAV介导的可编程的DNA修饰酶递送可应用于一系列动物年龄和品系以及各种单独的和多重的基因座。因此，这项技术可能在加速体内和组织祖细胞中基因功能和相互作用可被询问的速度方面有重要的应用。最终，这种系统可能适用于使得能够对可能特异性地影响干细胞表型的候选和未知基因靶标进行快速的且直接的体内筛查。