[发明专利]用于表征蛋白质复合物的方法

说明书

本文提供了用于表征在蛋白质药物产物和可溶性配体之间形成的蛋白质复合物的方法。所公开的方法可以确定蛋白质复合物的大小、异质性和构象。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月30日提交的美国临时专利申请号62/724,700的权益和优先权，该临时专利申请以引用的方式整体并入。

技术领域

本发明整体涉及表征蛋白质复合物的系统和方法。

背景技术

单克隆抗体(mAb)是一个正在发展的治疗领域，目前市场上有50多种单克隆抗体在售。多于一种单克隆抗体的组合疗法具有改善现有的单药疗法的功效的潜力。某些可溶性物质，尤其是具有若干重复表位的多聚体物质，可以两种或多种抗体结合，导致形成大型复合物。大型异质性抗体复合物的产生被称为“纸娃娃换装(paper-dolling)”。大型复合物可以被吞噬作用迅速消除，从而减少抗体的功效。大型蛋白质复合物也可以增加mAb的免疫原性。

蛋白质复合物的大小范围从纳米到可见颗粒，使它们难以通过单一分析技术来表征。一种用于确定从约1nm至约1μ的颗粒大小的最普遍的技术之一是动态光散射法(DLS)。DLS是一种用于确定蛋白质大小分布谱的分析技术，适用于高通量应用(Zhou，M.，et al.，ChemMedChem，11：738-756(2016))。蛋白质在溶液中的布朗运动导致光发生散射，由此产生的散射强度随着颗粒大小而波动。因此，就多分散性而言，可以确定分布的平均半径和宽度。然而，DLS结果通常偏向较大的颗粒，并且颗粒必须相差至少三倍才能解决。因此，仅DLS不足以分析蛋白质复合物。

由于蛋白质复合物的宽泛的大小范围，很多聚集体样品的高多分散性需要基于分离的方法来提供更详细的信息。分子排阻色谱法(SEC)是目前最常用的蛋白质分离色谱技术(Brusotti，et al.，Chromatographia，81：3-23(2018))。在SEC中，根据分子的流体动力学体积或大小进行分离。较小的分子的保留时间更长，因为它们能够扩散到固定相的孔中，而较大的分子则首先洗脱，因为它们被排除在孔外。然而，SEC受到分子量排阻限、样品至固定相的吸附、高压和高流速下的剪切降解以及无法根据组成来分离分析物的限制。

当流场流动分馏法(FFF)被用于分离大型蛋白质和高摩尔质量聚合物时，它是有前景的SEC的替代方法。FFF样品分离使用流动辅助分离和分馏方法，其中分析物通过扩散系数的差异沿着带状通道分离(Fraunhofer，W.and Winter，G.，Eur.J.Pharm.Biopharm，58：369-383(2004))。FFF可以分离宽泛的大小范围(从纳米到微米)的分析物。FFF的开放通道可减少样品损失、降低压力和降低剪切速率。虽然FFF已经与其他分子技术(诸如检测蛋白质聚集体的光散射法)组合使用，但是仍然越来越需要对蛋白质复合物(包括mAb和可溶性配体复合物)的异质性和构象进行更充分地表征。

因此，本发明的目的是提供用于鉴定具有形成大型蛋白质复合物能力的蛋白质药物产物的方法。

本发明的另一个目的是提供鉴定和表征蛋白质药物产物和可溶性配体复合物的方法。

发明内容

提供了用于表征样品中的蛋白质复合物的方法。一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来评估样品中的蛋白质复合物的化学计量和大小分布的方法：通过不对称流场流分馏法(A4F)来分馏样品，以及使用多角度激光光散射法(MALLS)来确定样品中的蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布。在一些实施方案中，蛋白质复合物含有抗体或结合至抗体的配体的融合蛋白。配体通常是可溶性配体。配体可以是单体或多聚体。在一个实施方案中，配体可以是同源二聚体或异源二聚体。在另一个实施方案中，蛋白质复合物包含抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物或者由抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物组成。