[发明专利]寡核苷酸的检测方法或定量方法

说明书

本发明提供了用于寡核苷酸的检测方法和寡核苷酸的定量方法，与常规信号放大(PALSAR)测定方法相比，所述方法表现优异的特异性和定量性。在本发明中：将待测靶标寡核苷酸与互补核酸探针(3'‑靶标序列的互补序列‑5')杂交，或将具有添加到其上的给定碱基(聚(A)等)的待测靶标寡核苷酸与互补的核酸探针(3'‑靶标序列的互补序列+给定碱基的互补序列‑5')杂交，通过使用单链特异性核酸酶分解并去除不完全的杂交产物，并通过PALSAR方法测定剩余的完全杂交产物中包含的核酸探针。

技术领域

本发明关于具有高灵敏度以及优异的特异性和定量性的寡核苷酸的检测方法和定量方法。

背景技术

核酸药物引起序列特异性基因沉默，因此其作为诸如遗传性疾病和顽固性疾病等难以治疗的各种疾病的新型治疗剂，近年来引起了极大的关注(非专利文献1，Ando 2012)。

在药物开发的探索阶段的药代动力学/药效学(PK/PD)筛查测试中，在非临床阶段的安全性、药理学和药代动力学测试中，以及在临床阶段，在接受药物施用的动物或人类生物样品中测定药物浓度。为了获得新药的批准，有必要获取生物样品中药物浓度的数据，并按照厚生劳动省条例所确立的准则提交与安全性和药代动力学有关的材料。

Ando等人报道，通过用发射正电子的核素标记核酸药物，可以无创地，实时地对生物体内的行为进行三维分析(非专利文献1，Ando 2012)。Healey等人报道，通过使用茎环RT-PCR方法(非专利文献3，Chen 2005)，可以实现0.01pg/μL的定量下限(非专利文献2，Healey 2014)。

但是，近年来，人工核酸和递送材料的发展使得能够以低剂量进行治疗。因此，生物样品中的药物浓度变得比以前更低，并且需要更灵敏的测定系统来检测这些低浓度的药物。此外，为了遵循厚生劳动省条例所确立的准则，该测定系统必须具有独立于操作者的高定量性，因此不适合采用作为半定量方法的PCR方法进行测定。

另外，传统的测定系统具有以下问题：当核酸药物中使用的寡核苷酸被代谢并从5'或3'端分解时，无法将其与待测的完整寡核苷酸区分开，从而无法测定出准确的药物浓度。

为了区分待测的完整寡核苷酸及其代谢产物，并特异地测定具有生物活性的核酸药物，Yu等人开发了杂交-连接ELISA法(非专利文献4，Yu2002)。在该方法中，使用含有与待测寡核苷酸互补的序列的“模板”寡核苷酸和“连接探针”。“模板”寡核苷酸具有与互补序列的5'端的核苷酸邻接的另外的9聚核苷酸，且在3'端具有生物素。“连接探针”是具有与另外的9mer(单体单元)核苷酸互补的序列的9mer寡核苷酸。“连接探针”在5'端具有磷酸，在3'端具有异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin)。因此，当待测寡核苷酸是完整的时候，完整的寡核苷酸和连接探针在模板寡核苷酸上无间隙地杂交。通过用连接酶处理这种杂交的产物，将完整的寡核苷酸和连接探针连接。另一方面，如果待测寡核苷酸被代谢并且3'端侧的核苷酸缺失，则该连接不会发生。通过使用生物素将连接产物结合至固相，通过洗涤除去未反应的连接探针，并通过ELISA法检测固定的连接产物的3'端的异羟基洋地黄毒苷(参见非专利文献4，Yu 2002的图1)。

Wei等人公开了在连接酶处理后进行S1核酸酶处理，以提高杂交-连接ELISA方法的特异性(非专利文献5，Wei 2006)。

然而，杂交-连接ELISA方法因为必须考虑待测寡核苷酸的序列来设计最佳的连接探针序列，所以复杂且不适用于多重化(multiplexing)。

为了开发满足药物开发中的上述高要求的检测或定量寡核苷酸的高度通用的方法，本发明人基于全新的思想开发了具有高灵敏度以及优异的特异性和定量性的检测或定量寡核苷酸的方法，从而完成了本发明。

现有技术文献

专利文献

专利文件1：WO 2013/172305

非专利文献