[发明专利]接种有细胞的基质的冷冻保存及相关方法

权利要求书

1.一种冷冻保存基质上的细胞的方法，所述方法包括：

提供接种有单层未成熟视网膜色素上皮(RPE)细胞的生物相容性聚合物基质，所述聚合物基质提供细胞接种表面；

鉴定何时i)所述单层未成熟RPE细胞在所述基质上达到90％到99％的汇合，以及ii)大部分所述未成熟RPE细胞未完全色素沉着；

根据所述鉴定，将接种有细胞的基质暴露于约-1℃/分钟至约-30℃/分钟的受控降温速率，直至达到低于-20℃的第一温度。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述接种有细胞的基质达到低于描述接种的细胞的潜热释放温度的温度。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述表面基本上平行于接种在所述基质上的所述单层未成熟RPE细胞，足以响应于所述接种的细胞的潜热释放而诱导成核和有效的温度补偿。

4.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：

在所述受控降温速率之后，将所述接种有细胞的基质在所述第一温度下保持第一时间段，所述第一温度在-20℃至约-100℃之间，以获得温度均匀性；以及

将所述细胞在低于所述第一温度50℃以内的储存温度下保持第二时间段，从而获得冷冻保存的细胞。

5.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：

在所述受控降温速率之后，将所述接种有细胞的基质在所述第一温度下保持第一时间段，所述第一温度在-20℃至约-100℃之间；以及

进行第二受控降温速率，以最终将所述细胞在低于-196℃的储存温度下保持第二时间段，从而获得冷冻保存的细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第二时间段是24小时至60个月。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述第二受控降温速率是约-1℃/分钟至约-30℃/分钟。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述单层细胞的细胞接种密度是200,000到700,000个细胞/毫升细胞悬浮液，或100,000至350,000个细胞/平方厘米基质表面。

9.如权利要求1所述的方法，其中超过50％的所述RPE细胞具有鹅卵石形态。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述RPE细胞无色素沉着或具有部分色素沉着。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是表现出选自以下的冷冻保存活力特性的RPE细胞：(i)未色素沉着或部分色素沉着的RPE细胞，(ii)粘附但未极化的、部分极化的或完全极化的RPE细胞，(iii)具有或不具有成熟鹅卵石形态的RPE细胞，(iv)基因表达水平低于成熟细胞的基因表达水平或缺乏特定基因表达的RPE细胞；以及(v)处于汇合或亚汇合超过90％单层构型的RPE细胞。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述基质具有一种或多种选自以下的特性：(i)基质的热膨胀系数，(ii)基质弹性参数，(iii)基质厚度，(iv)表面修饰，(v)抗剪切力，所述特性有助于在冷冻保存和解冻过程中增强所述接种的细胞的活力和所述基质的功能。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述生物相容性聚合物包含聚对二甲苯。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述鉴定包括确定何时所述未成熟RPE细胞的至少一种或多种顶端分泌物、基底端分泌物或非极性特定分泌物的水平低于成熟RPE细胞的所述水平。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述顶端分泌物包含αB结晶蛋白、透明质酸、基质金属肽酶(MMP)-9、色素上皮衍生因子(PEDF)、转化生长因子(TGF)-β、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-I或机械生长因子(MGF)-E8。