[发明专利]具有改良链置换能力的突变型DNA聚合酶

说明书

本发明公开了相对于对应的未修饰聚合酶具有增加的5′‑3′链置换活性与显著降低的5′‑3′核酸外切酶和核酸内切酶活性的DNA聚合酶。所述聚合酶可用于多种公开的引物延伸方法。还公开了相关的组合物，所述组合物包括重组核酸、载体和宿主细胞，其可用于例如DNA聚合酶的生产。

优先权信息

本专利申请要求于2018年9月13日提交的美国临时专利申请号62/730,908的优先权，其内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的。2018年8月29日创建的150,900字节的机器格式IBM-PC、MS-Windows操作系统的文件SequenceListing_31934-US.txt中写入的序列表全文以引用方式并入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明提供了具有改良活性的DNA聚合酶，其包括增加的5'-3'链置换活性和显著降低的5'-3'核酸外切酶/核酸内切酶活性，以及此类聚合酶在各种应用中的用途，其包括核酸多核苷酸延伸和扩增。

背景技术

DNA聚合酶负责基因组的复制和维持，该作用对于准确地一代一代地传递遗传信息至关重要。DNA聚合酶在细胞中起负责DNA合成的酶的作用。它们在金属活化剂存在(诸如Mg²⁺)的情况下，按照复制的DNA模板或多核苷酸模板指示的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，其包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每个DNA合成过程期间，DNA模板复制一次或至多几次，以产生相同的复制品。相反，在体外，DNA复制可以诸如在聚合酶链式反应期间(参见例如美国专利号4,683,202)重复很多次。

在用聚合酶链式反应(PCR)的初步研究中，在每轮DNA复制的开始添加DNA聚合酶(参见美国专利号4,683,202)。随后，确定可以从在高温下生长的细菌获得热稳定DNA聚合酶，并且确定这些酶仅需要添加一次(参见美国专利号4,889,818和美国专利号4,965,188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶不会不可逆地失活。结果，人们可以进行重复的聚合酶链式反应循环，而无需在每个合成加成过程的开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶、特别是热稳定的聚合酶是重组DNA研究和疾病的医学诊断中众多技术的关键。特别是对于诊断应用，靶核酸序列可能只是所讨论的DNA或RNA的一小部分，因此可能难以在不进行扩增的情况下检测出靶核酸序列的存在。

DNA聚合酶的整体折叠模式类似于人类的右手，并包含手掌、手指和拇指三个独特的亚结构域。(参见Beese等人，Science 260:352-355,1993)；Patel等人，Biochemistry34:5351-5363,1995)。尽管手指和拇指亚结构域的结构在大小和细胞功能不同的聚合酶之间差异很大，但催化性的手掌亚结构域均可重叠。例如，与引入的dNTP相互作用并在化学催化作用期间稳定过渡态的基序A可重叠，其中在哺乳动物polα和原核pol I家族DNA聚合酶之间的平均偏差约为一(Wang等人，Cell 89:1087-1099,1997)。在结构上基序A以主要包含疏水性残基的反平行β-链起始并且延续至α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的一级氨基酸序列极为保守。在基序A的情况下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:22)保留在来自由数百万年进化分离的生物体包括例如水生栖热菌、沙眼衣原体和大肠杆菌的聚合酶中。

除了高度保守之外，DNA聚合酶的活性位点也已证明是相对易突变的，其能够适应某些氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如Patel等人的美国专利号6,602,695)。此类突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择性优势。

链置换是指在DNA合成期间，聚合酶置换而不是降解所遇到的下游DNA的能力。在链置换复制期间，一次仅复制一条DNA链。链置换合成释放单链DNA，然后将其复制为双链DNA。许多热稳定DNA聚合酶表现出快速和持续的引物延伸DNA合成，但是链置换DNA合成效率低下。本公开提供了在高温下具有改良链置换活性的热稳定DNA聚合酶，其导致改良的5'-3'链置换活性和显著降低的5'-3'核酸外切酶/核酸内切酶活性。