[发明专利]腺病毒体

说明书

本发明涉及其中编码蛋白V的基因和/或编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下的重组腺病毒核酸，涉及其中腺病毒核苷酸序列以使其不再能够产生外壳蛋白中的一种或多种外壳蛋白的方式突变的重组腺病毒核酸，涉及填充有此类腺病毒物质的细胞囊泡、提供有此类腺病毒物质的细胞，并且涉及它们的方法和用途。

技术领域

本发明涉及其中编码蛋白V的基因和/或编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下的重组腺病毒核酸，涉及其中腺病毒核苷酸序列以使其不再能够产生外壳蛋白中的一种或多种外壳蛋白的方式突变的重组腺病毒核酸，涉及填充有此类腺病毒物质的细胞囊泡、提供有此类腺病毒物质的细胞，并且涉及它们的方法和用途。

背景技术

基因治疗是一种其中将遗传物质引入到细胞中的治疗方法，在细胞中其可取代缺陷基因或在细胞中其编码治疗分子(诸如细胞因子)或治疗抗体的表达。

使用合适的媒介物(诸如病毒载体)将这些基因递送到细胞中。病毒载体具有通过将其DNA插入细胞并复制到细胞中而感染细胞的天然能力。

腺病毒通常用作病毒载体。腺病毒是一种与呼吸道感染和结膜炎相关的充分表征的无包膜病毒。(Chu,R.L.,Clinical Cancer Research,2004,10,5299-5312)。

腺病毒是特别合适的病毒载体，因为它们既能够感染复制细胞也能够感染静止细胞，能够携带大片段DNA(高达30kbp)并且不整合到宿主细胞的基因组中。此外，可获得广泛的分子生物学知识，并且病毒可被有效地纯化至高滴度。

存在腺病毒的不同亚型，其中2型和5型最常用于递送媒介物目的。

完全成熟的人腺病毒5型病毒颗粒约为110纳米，形状为二十面体，并且含有由衣壳包围的包含双链DNA的核。

形成衣壳的主要蛋白为六邻体、五邻体和纤维蛋白，但衣壳还包括蛋白IIIa、VI、VIII和IX。本文中，纤维蛋白有利于与宿主细胞受体诸如柯萨奇-Ad受体(CAR)的结合。此外，发现蛋白IX在病毒颗粒的稳定性中起作用。(Lee,C.S.等人GenesDiseases,2017,4,43-63)。

病毒的核由大小为36kb的双链线性DNA基因组和蛋白IVa2、V、VII、末端蛋白、μ和腺病毒蛋白酶组成。

基因组由参与病毒DNA复制的早期基因E1A、E1B、E2、E3和E4、编码衣壳蛋白的中间基因pIX和IVa2和晚期基因L1至L5、以及核蛋白V和VII组成。

为了提高病毒载体的安全性，已经开发了不同的世代，每个世代包含对基因组的特异性修饰或缺失，从而改变病毒复制自身或诱导免疫应答的能力。

第一代腺病毒包含E1区域的缺失，以使病毒复制缺乏。然而，此类腺病毒载体的使用仍导致强免疫应答，这与高细胞毒性相关联。

因此，开发了第二代病毒载体，其中除E1区之外，还在E2和/或E4基因中进行特异性突变或缺失。虽然免疫应答显著降低，但仍观察到细胞毒性副作用。

因此，开发了第三代或无肠腺病毒载体，其中编码复制所需的酶或蛋白的所有基因被消除。然而，此类病毒带来纯化问题，因为它们需要存在合适的辅助病毒。(Jounaidi,Y,Curr Cancer Drug Targets.2007,7(3),285-301)。

在癌症治疗中，溶瘤病毒诸如条件复制腺病毒(CRAd)已成为选择性靶向癌细胞的强大工具。这种效果可以不同的方式实现。

首先，可在病毒DNA中引入特异性突变，诸如E1a基因中24个碱基对的缺失(AdΔ24)或E1b-55kDa基因的缺失(AdΔ1520)，这导致CRAd在健康细胞中的复制被禁止，而在癌细胞中这种突变被细胞缺陷补偿，从而导致病毒的复制并因此导致癌细胞的裂解。