[发明专利]用于测定多聚体蛋白质的量和纯度的方法和色谱系统

权利要求书

1.一种用于定量样品中蛋白质的量和/或纯度的方法，所述样品包含蛋白质、第一蛋白质杂质和第二蛋白质杂质的混合物，其中所述蛋白质和第一杂质结合至第一亲和基质并且第二杂质基本上不结合至第一亲和基质而结合至第二亲和基质，所述方法包括以下步骤：

a.将样品施加到包括第一亲和基质、第二亲和基质和检测器的色谱系统，其中第一亲和基质经由开关阀串行连接至第二亲和基质；

b.在第一组条件下将第二杂质从第一亲和基质洗脱至第二亲和基质；

c.切换开关阀以绕过第二亲和基质，在第二组条件下洗脱蛋白质通过检测器，并测定洗脱的蛋白质的量；

d.在第三组条件下洗脱第一杂质通过检测器并测定洗脱的第一杂质的量；

e.在第三组条件下从第二亲和基质洗脱第二杂质通过检测器，并测定洗脱的第二杂质的量，以及

f.定量样品中蛋白质的量和/或纯度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中与第一杂质相比，所述蛋白质具有较低的对第一亲和基质的亲和力。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质是异二聚体蛋白质，第一蛋白质杂质是第一同二聚体蛋白质，并且第二蛋白质杂质是第二同二聚体蛋白质，其中所述异二聚体蛋白质和第一同二聚体蛋白质结合至第一亲和基质并且第二同二聚体蛋白质基本上不结合至第一亲和基质而结合至第二亲和基质。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质包含第一免疫球蛋白CH3结构域和第二免疫球蛋白CH3结构域，其中所述第一和第二免疫球蛋白CH3结构域在它们对第一亲和基质的亲和力方面不同，并且其中所述样品包含混合物，所述混合物包含所述蛋白质、包含两个第一CH3结构域的蛋白质和包含两个第二CH3结构域的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的方法，其中第二CH3结构域包含H435R和Y436F氨基酸取代。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质是双特异性抗体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中第一亲和基质包含蛋白A且第二亲和基质包含蛋白G。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中第一组条件包括第一pH，第二组条件包括第二pH，并且第三组条件包括第三pH。

10.根据权利要求9所述的方法，其中第二pH低于第一pH，并且第三pH低于第二pH。

11.根据权利要求9或10中任一项所述的方法，其中第一pH为约pH 5.0至约pH 7.4，第二pH为约pH 4.3至约pH 5.6，并且第三pH为约pH 2.0至约pH 2.8。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中第一组条件、第二组条件和第三组条件包括流动相改性剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述流动相改性剂是选自LiCl、NaCl、KCl、MgCl₂和CaCl₂缓冲剂的盐缓冲剂。