[发明专利]用于测定多聚体蛋白质的量和纯度的方法和色谱系统

说明书

本发明涉及用于评估样品中多聚体蛋白质的量和/或纯度的色谱系统和方法，其中所述色谱系统包括经由开关阀连接的两种不同的亲和色谱层析基质。

发明领域

本发明涉及用于评估样品中多聚体蛋白质的量和/或纯度的色谱系统和方法，其中所述色谱系统包括经由开关阀连接的两个不同的亲和色谱基质。

发明背景

双特异性抗体是可以同时且选择性地结合至相同或不同抗原上的两个不同类型的表位的抗体。多个靶标与单个分子的结合是一个有吸引力的治疗概念，尤其是在肿瘤学和自身免疫性疾病领域。最广泛使用的应用是在癌症免疫疗法中，其中双特异性抗体经工程化以同时结合细胞毒性细胞和靶标(如要被破坏的肿瘤细胞)。另外，靶向多于一个分子可用于规避对平行途径的调节并避免对治疗的抗性。结合或阻断途径中的多个靶标可能对阻止疾病有益，因为大多数病况在整个人体中都有复杂的多方面影响。

已经提出了多种双特异性抗体形式，并且目前正在开发中。一种这样的形式基于具有改善的药代动力学特征和最小的免疫原性的标准的完全人IgG抗体(参见美国专利号8,586,713和WO2016/018740)，如图1示意性所示。单个共同的轻链和两个不同的重链组合形成这样的双特异性。重链之一包含取代的Fc序列(下文称为“Fc*”)，其由于在CH3结构域中的H435R/Y436F(通过EU编号系统；通过IMGT外显子编号系统是H95R/Y96F)取代而大大降低了Fc*与蛋白A的结合。Fc*和Fc重链和共同轻链的共表达的结果是，产生了三种产物：其中两种(FcFc和Fc*Fc*)相对于重链是同二聚体的，和其中一种(FcFc*)是所需的异二聚双特异性产物。由于与高亲和力FcFc重链同型二聚体或弱结合Fc*Fc*同二聚体相比，对Fc结合蛋白(例如蛋白A)具有中等结合亲和力，因此Fc*序列允许在市售亲和色谱柱上选择性纯化FcFc*双特异性产物。

另一种抗体形式是在WO2013/166604中描述的所谓的“单臂”抗体，在图2A中示意性地显示。该异二聚抗体例如由例如两个不同的重链和仅一个轻链组成。在一个这样的实例中，与轻链偶联的重链包含Fc*序列，而没有轻链的重链包含常规的Fc序列。因此，初始反应混合物包含三种产物，两种同二聚体(FcFc和Fc*Fc*)和所需的异二聚体FcFc*产物，可以使用亲和色谱法对它们进行分离。

另一个可能的抗体形式是具有C末端单链可变片段(ScFv)的抗体构建体，如在图2B中示意性地显示。这些抗体可以是单特异性或双特异性的，并且包含单个共同轻链和两个不同的重链。在一个实例中，一个重链具有Fc*序列并偶联至ScFv，而另一个重链具有天然Fc序列且无ScFv。在另一个实例中，具有ScFv构建体的重链具有天然Fc序列，而Fc*重链不具有ScFv。提供了另外的实例，其中取消了与亲和柱结合的另外的突变是具有Fc*突变的同一个链上的重链可变区(VH)的突变，如在U.S.9,493,563(VH3和Fc的突变描述为IMGT 3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86、90)中提供，其全部内容通过引用结合至本文中。如以上实施方案中所述，可以使用差分结合亲和色谱法分离FcFc*异二聚体与FcFc和Fc*Fc*同二聚体的三组分混合物。

在双特异性抗体的商业规模生产领域中需要评估抗体生产和纯化的各个阶段中异二聚体的相对和绝对的量和纯度。为此，需要异二聚体和两种同二聚体杂质之间的有效解析。而且，在细胞培养过程以及抗体的纯化过程中需要质量控制测量的速度和效率。本发明通过提供新颖的色谱系统和方法满足了这种和其他需求。

提出前述讨论仅仅是为了更好地理解本领域面临的问题的性质，并且不应以任何方式解释为对现有技术的认可，也不应该将本文中任何参考文献的引用解释为认可该引用构成了本申请的“现有技术”。

发明内容

下文描述本发明的各种非限制性方面和实施方案。

本发明描述了一种包括开关阀的新型色谱系统和定量地评估样品中异二聚体级分的量和/或纯度的方法。