[发明专利]利用多重荧光染料对未缔合的病毒尺寸颗粒进行流式细胞术评估的方法、试剂盒和染色剂组合物

说明书

在用多重荧光染料染色的未缔合的病毒尺寸颗粒的流式细胞术评估中，流体样品用包含多重荧光染料的水性稀释的染料配制剂进行染色。水性稀释的染料配制剂的制备包括制备具有荧光染料的浓缩的染料配制剂的第一制备工序，其中将以干粉混合物形式提供的荧光染料与包含DMSO的第一液体介质混合并溶解于包含DMSO的第一液体介质中。第一制备工序之后，添加水性液体稀释剂以稀释第一液体介质，并在使荧光染料保持在溶液中的同时使液体介质转化为水性液体介质，该水性液体介质可包含作为微量摩尔组分但有显著浓度的DMSO。经染色的流体样品可包含溶解的二糖。

交叉引用

本申请要求名称为“利用多重荧光染料对未缔合的病毒尺寸颗粒进行流式细胞术评估的方法、试剂盒和染色剂组合物”的美国临时专利申请号62/713,377的优先权权益，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文。

背景技术

流式细胞术是用于测量颗粒在流体样品中流动通过流式细胞仪的检查比色皿(通常称为“流动池”)时颗粒的物理和/或化学特性的分析技术。尽管样品流体可通过使样品流体经受各种刺激来研究，但是通常为光形式的辐射是一种常见的刺激技术。流式细胞术是重要的分析技术，其已被广泛接受用于分析生物材料的颗粒，尤其是用于研究细胞的特性。最近，流式细胞术已被调整用于检测未缔合(溶液中游离)的病毒颗粒(通常称为病毒体)，以及与病毒具有相似尺寸的生物材料的其他极小颗粒(称为病毒尺寸颗粒)。此类病毒尺寸颗粒通常具有小于1微米、小于500纳米并且在许多情况下小于300纳米、小于200纳米或甚至小于100纳米的大小。一些病毒尺寸颗粒的大小在几十纳米量级，但是许多颗粒的大小为至少10纳米，通常至少20纳米，甚至至少30纳米或更大。有许多类型的具有范围为20纳米至300纳米的颗粒大小的病毒和其他病毒尺寸颗粒。本文所用的颗粒大小通常是指颗粒的最大横截面尺寸(例如，球体的直径，杆的长度)。通过流式细胞术准确分析此类小颗粒的系统和程序一直具有挑战性，包括分析结果的可重复性。

用于检测细胞级大小的颗粒(大小通常在几微米或更大)的传统流式细胞术依赖于通过光散射检测的颗粒鉴定。可通过补充使用与特定生物结合位点或表位结合的荧光抗体染色剂(其荧光发射签名可与光散射检测分开检测)，提供有关通过光散射检测鉴定的颗粒的特定生物学属性(例如，细胞类型或特定病毒感染细胞)的其他信息。然而，对于病毒尺寸颗粒，通过光散射检测的颗粒鉴定通常是不实际的，因为小尺寸颗粒的大小变得更接近用作流式细胞术评估的激发源的光的波长。因此，已开发了用于检测和分析荧光发射响应的技术来鉴定颗粒的存在以及确定特定的颗粒属性。设计用于通过使用荧光染色剂检测和计数病毒尺寸颗粒的流式细胞仪的实例是3100流式细胞仪(SartoriusStedim Biotech)。

用于流式细胞术评估病毒尺寸颗粒的一类非常有用的荧光染色剂是所谓的荧光染料。在溶液中为游离、未结合状态时，荧光染料对激发光源仅显示非常弱的荧光响应(量子产率)。然而，与颗粒结合时荧光染料的分子取向在构象上变得更加刚性时，荧光量子产率显著提高，相对于游离、未结合状态的荧光染料的荧光响应通常提高了一个数量级或更多。这允许在来自未结合的染料分子的相对弱的背景荧光上识别出结合的染料分子的强荧光信号。荧光染料的功能与传统荧光团染色剂的功能明显不同，所述传统荧光团染色剂通常为荧光抗体染色剂的形式，通常用于细胞的流式细胞术评估中。此类荧光团染色剂无论与颗粒结合还是在溶液中处于游离、未结合状态，都表现出强烈的荧光响应。