[发明专利]色谱质量控制系统

说明书

本发明涉及通过使用可变路径长度分光光度计进行质量测试来实时控制色谱过程的方法。

相关申请

本申请要求于2018年10月9日提交的美国专利申请系列号62/766,253的优先权，其整体并入本申请。

技术领域

本发明涉及通过使用可变路径长度分光光度计进行质量测试来实时控制色谱过程的方法。

背景技术

纯化生物分子的色谱过程是麻烦且耗时的过程。它需要能够监测UV吸收度、电导率、pH、流速和其他参数的设备。亲和色谱通常是纯化过程中的第一色谱步骤，并且是将感兴趣的蛋白主要从收获的细胞培养液或发酵收获物的复杂混合物中分离出来的地方。装载在色谱柱上的物料量、物料在色谱柱上的流速以及色谱柱尺寸或床高决定了物料在色谱柱中的停留时间。停留时间与动态结合容量(GE纸)有直接关系。色谱介质的动态结合容量是在未结合的蛋白发生显著穿透之前，在实际流动条件下该介质将结合的目标蛋白的量。对于任何给定的停留时间，存在与动态结合容量相关的穿透曲线。动态结合容量反映随着流速增加可能发生的传质限制的影响，并且与饱和或静态容量的测定相比动态结合容量在预测实际过程性能时更有用。亲和色谱过程中的穿透曲线描述离开色谱柱且未结合的物料的百分比。为了设计有效且有用的过程，应当确定取决于必须处理的质量的量的给定批次的适当的停留时间、装载和循环次数。通常，动态容量将随着停留时间的减少而减少，但是动态容量减少的速率会因介质不同而显著变化。理想的介质将在流速范围内具有有效的传质性能，但实际上流速有一个由介质的机械强度确定的上限。最大动态结合容量的过程标准的优化导致较少的过度工艺放大需求，以及减少了工艺时间、成本和蛋白质损失。即使单色谱柱色谱步骤也是如此，并且当纯化过程中使用几个色谱柱进行连续色谱时，这是复杂的。在进料浓度和/或流速随时间变化或色谱柱材料不同的情况下，动态结合容量将不同或将随时间变化。此外，色谱柱中材料的使用会随着时间而变化，并且当色谱柱是新的时使用的过程条件将与色谱柱较旧时不同。因此，需要提供关于在给定穿透水平下动态结合容量以及蛋白质滴度和质量信息的实时信息。

使用可变路径长度紫外分光光度计，而不是使用具有有限的线性范围的单路径长度紫外吸收传感器。由于可变路径长度分光光度计可以提供以吸光度/mm为单位的斜率值，所述斜率值可以使用消光系数(mL/cm*mg)容易且准确地转换为蛋白质的浓度，因此可以计算出准确的质量。

发明内容

在过去，使用线性范围有限的单路径长度紫外吸收传感器来确定色谱参数。在本发明中，使用可变路径长度紫外分光光度计，因为于可变路径长度分光光度计可以提供以吸光度/mm为单位的斜率值，所述斜率值可以使用消光系数(mL/cm*mg)容易且准确地转换为蛋白质的浓度，因此可以计算出准确的质量。

本发明涉及用于确定色谱柱的穿透百分比的方法，所述方法通过以下步骤进行：通过将收获的细胞培养液流经色谱柱足够长的时间以建立不变的信号来用斜率光谱确定给定蛋白质的初始斜率(m0)，以及通过将传感器放置在色谱柱的入口并用斜率光谱测量斜率来确定第一斜率(m1)，以及通过将传感器放置在色谱柱的出口并用斜率光谱测量斜率来确定第二斜率(m2)，以及通过计算％BT＝(m2-m0)/(m1-m0)*100来计算穿透百分比。

本发明还涉及方法用于确定色谱柱的蛋白质滴度的方法，所述方法通过以下步骤进行：通过将收获的培养细胞液流经色谱柱足够长的时间以建立不变的信号来确定初始斜率(m0)，其中初始斜率由斜率光谱确定，然后通过将传感器放置在色谱柱的入口并用斜率光谱测量斜率来确定第一斜率(m1)，然后通过计算滴度＝(m1-m0)/EC来计算色谱柱的滴度，其中EC是蛋白质的消光系数，其单位为mL/mg*cm。

本发明涉及用于确定装载在色谱柱上的蛋白质的实时质量的方法，所述方法包括如上所述确定色谱柱的蛋白质滴度，并通过计算质量柱1(mg)＝滴度*流速*时间，来计算装载在色谱柱上的蛋白质的实时质量。