[发明专利]癌抗原特异性CD8+T细胞的制备及冷冻保存方法

说明书

本发明涉及一种制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；(c)增加在步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；(d)冷冻在步骤(c)中获得的CD8+T细胞；以及(e)解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。

技术领域

本发明涉及分离、增殖和冷冻保存抗原特异性CD8+T细胞的技术。

背景技术

由于CD8+T细胞与树突细胞、CD4+T、NK细胞等其它细胞相比功能相对简单，因而在抗肿瘤免疫治疗中意外的副作用发生的可能性较小。一般来说， MHCⅠ类/肽多聚体用于分离抗原特异性CD8+T细胞，但这种方法的缺点是，由于细胞分离后细胞凋亡导致的细胞死亡率很高，因此需要长期培养才能产生足够数量的抗原特异性CD8+T细胞。因此，需要一种替代标志物，能够通过替换刺激T 细胞受体(TCR)的MHC多聚体来分离抗原特异性CD8+T细胞；为此，使用蛋白4-1BB(CD137)。

4-1BB是一种可诱导的共刺激分子，在活化的T细胞中表达；特别是，已知通过4-1BB进行刺激不仅可以增强CD8+T细胞的活性，而且可以通过增加抗凋亡分子(如Bcl-2、Bcl-XL和Bfl-1等)的表达来抑制活化诱导的细胞死亡(AICD)。

本发明人先前公开了使用活化的CD8+T细胞表达4-1BB或使用抗4-1BB 抗体或五聚体COMP-4-1BBL蛋白分离和增殖抗原特异性CD8+T细胞的方法(韩国注册专利号100882445、101103603、101503341)。本说明书的背景技术是与上述专利披露的相同的T细胞或其生产方法。

这些专利参考文献公开了分离和大规模培养用于以病毒抗原 (EBV/LMP2A、CMV/pp65)或自体抗原(WT-1、hTERT、NY-ESO-1等)形式的外来抗原的抗原特异性CD8+T细胞的技术。然而，在现有的采用被覆有抗4-1BB 抗体的平板分离抗原特异性CD8+T细胞的技术中，分离细胞的纯度随操作人员的技能不同而有很大差异，细胞的培养过程也非常复杂。此外，由于生产过程需要 30天或更长时间，因此需要持续的努力来尽可能缩短生产用于临床应用的细胞疗法所需的时间。

另外，在制备CD8+T细胞时，虽然由于患者的治疗计划和反复治疗等原因，有必要对细胞进行冷冻保存，必要时进行解冻，但迄今为止，T细胞的存活率、增殖能力，以及癌抗原特异性活性都在T细胞冻融后降低。

因此，为了更有效地治疗患者，有必要在短时间内更容易地分离出抗原特异性CD8+T细胞并获得高纯度，以缩短整个培养过程使其快速增殖，并开发一种冷冻保存T细胞的方法，以尽量减少T细胞性能的退化。

发明详述

要解决的问题

本发明旨在提供一种产生癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，该方法即使在所产生的CD8+T细胞被冷冻保存之后也能够维持高水平的细胞活力和癌抗原特异性活性。

本发明旨在提供一种通过包含冷冻保存步骤的方法制备的含有CD8+T 细胞的药物组合物。

本发明旨在提供一种方法，其中解冻冷冻的抗原特异性CD8+T细胞并再次进行大规模培养，从而可获得抗原特异性更强的CD8+T细胞，同时其保持高水平的细胞活力和癌抗原特异性活性。

解决问题的手段

1.一种制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞； (c)增加在步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和(d)冷冻在步骤(c)中获得的CD8+T细胞。