[发明专利]高通量高效细胞转染的方法及装置

说明书

遗传物质和其他材料向细胞的转移是在无需人工干预、自动化、高通量、连续的过程中进行的。使用微流体动力学鞘流结构的系统包括将细胞从含有细胞培养基的侧流输送至包含电穿孔缓冲液的中央流的装置。电穿孔可以在组件中进行，在该组件中，两个或多个微流体通道以平行结构配置提供，并且在该组件中，各种层可以堆叠在一起以形成层压型结构。

优先权声明

本申请根据美国专利法第35编第119条(e)的规定，要求2018年8月31日提交的序列号为62/725,382的美国临时专利申请的优先权，并通过引用将其全部内容合并与此。

背景技术

生物学、医学、药物研究和其他领域的许多应用都涉及将遗传物质引入细胞的技术。当应用细菌或非动物真核细胞(包括植物细胞)时，经常使用术语“转化”。“转染”几乎总是指真核细胞的研究，而“转导”通常适用于病毒介导的基因转移到真核细胞中。

感兴趣的材料不仅可以包括DNA、siRNA、mRNA、RNP复合物，还可以包括小分子或蛋白质，例如抗体。在许多情况下，这种“货物”材料的转移涉及在细胞膜上打开瞬时孔隙或“洞”，以允许其吸收，从而改变或从基因上修饰细胞。

常用于暂时透化细胞的技术是电穿孔。当进行电穿孔时要考虑的参数包括细胞特性(例如细胞大小、形状、膜结构、表面电荷)、细胞环境以及所施加电场的属性(例如，脉冲强度、脉冲数量、脉冲持续时间、脉冲形状和/或频率)。通常认为，电穿孔过程中的膜透化发生在所施加的电场诱导跨膜电势的阈值或“电穿孔阈值”之后，并且在给定的施加的电场下，存在成功电穿孔所需的脉冲数量和脉冲长度的阈值。Schwan方程和相关推导常用于估计细胞的跨膜电位，该电位根据相关实验参数而开发，包括外加电场、细胞大小、介质电导率、细胞质和细胞膜以及膜厚度(Analytical Description of Transmembrane VoltageInduced by Electric Fields on Spheroidal Cells，Biophysical Journal，第79卷，2000年8月，670-679页)。

发明内容

传统上，通过电穿孔对细胞进行的基因修饰是使用比色杯进行的批量处理。不太普遍的，可能采用批量配置的一些缺少自动化功能的商业设备。

例如，现有的电穿孔过程通常使用专门的低电导率缓冲液，这可能会对细胞活力产生负面影响，尤其是在长时间暴露的情况下。因此，批量加工需要若干缓冲液更换和清洗步骤，这使得该方法耗费大量人力，并且难以扩大规模以满足不断增长的大批量生产需求。手动洗涤和/或过滤步骤也很慢，因此细胞仍会暴露在电穿孔缓冲液中达数分钟至约一小时的时间。这些步骤通常与细胞流失(细胞回收率低)有关。高通量转染系统同样缺乏。

随着细胞疗法趋向于使用同种异体而非自体细胞来源进行大规模生产，使用批量方法对细胞疗法进行生物处理变得越来越棘手。

此外，市售的电穿孔装置会使生物制品与电极直接接触而暴露，从而由于局部加热和法拉第副产物(水合氢离子、羟基离子、氯、自由基和电极分解副产物(例如，铝离子和微粒))而造成潜在损坏。没有微流体，许多传统的电穿孔方法无法将热量从热敏感的生物实体中转移，或者不能有效地进行转移。在某些情况下，细胞(或其他基质)和有效载荷(货物)缺乏共定位，导致效率低下和(有价值的)材料损失。

因此，需要至少解决上述一些问题的设备和方法。

本文描述了以无需人工干预、自动化、高通量、连续的过程进行遗传物质或其它材料向细胞转移的方法。

一些实施方案依赖于微流体动力学鞘流结构，并且包括将细胞从含有诸如细胞培养基的侧流输送至包含电穿孔缓冲液的中央流的装置。电穿孔可以在组件中进行，在组件中，两个或多个微流体通道以平行结构配置提供，并且在组件中，各层可以堆叠在一起以形成层压型结构。每个微流体通道都配有一对电极，电极的结构最好能承受长期、连续和高通量的操作。