[发明专利]显微镜和显微镜检查的方法

说明书

本发明涉及一种显微镜，包括用于提供照明光的光源、用于以可变方式产生待选择的照明光的照明图案的可控操纵设备、具有用于将照明图案引导至待检验样品的显微镜透镜的照明光束路径、具有用于检查由样品发出的荧光的多个像素的检测器、用于将由样品发出的荧光引导至检测器的检测光束路径、用于使照明光和荧光分离的主分束器、用于控制操纵设备并评估由检测器测量的数据的控制和评估单元。所要求保护的显微镜的特征在于，操纵设备在样品平面的光学共轭平面附近、被设置在主分束器上游的照明光束路径中，使得使用控制和评估单元并且以待选择的读出图案个别地激活检测器的像素，并且控制和评估单元被设计为个别地或以取决于所选择的照明图案的所选择的读出图案激活检测器的像素。本发明进一步涉及一种用于显微镜检查的方法。

技术领域

在第一方面，本发明涉及根据权利要求1的前序部分的显微镜。在第二方面，本发明涉及根据权利要求28的前序部分的显微镜检查的方法。

背景技术

通用类型的显微镜包括以下部件：用于提供照明光的光源、用于可变地产生照明光的待选择的照明图案的可控操纵设备、具有用于将照明图案指引至待检验样品上的显微镜物镜的照明光束路径、具有用于检测由样品发出的荧光的多个像素的检测器、将由样品发出的荧光指引至检测器的检测光束路径、用于使照明光和荧光分离的主分束器、以及用于控制操纵设备并评估由检测器测量的数据的控制和评估单元。

在通用类型的显微镜检查方法中，执行以下步骤：由光源提供照明光、由用于可变地产生照明光的待选择的照明图案的可控操纵设备产生照明图案、将照明图案经由带有显微镜物镜的照明光束路径指引至待检验样品上、由样品发出的荧光经由检测光束路径指引至具有多个像素的检测器上，其中，照明光和荧光由主分束器分离，最后由检测器检测该荧光。

在生物医学研究中，对活细胞成像的兴趣正在稳步增长。这对所使用的成像系统，特别是显微镜提出了严格要求。一方面，为了遵循样品中的动态过程，需要高图像刷新率。另一方面，观察对样品的发育和行为的影响应当尽可能小。因此，有必要最小化入射光剂量和入射能量密度，也就是说，用于给定的焦点尺寸的激光功率，因为光对细胞具有毒性作用，从而缩短了细胞的寿命。原则上，通过宽场显微镜很好地满足这两个条件。然而，此时的问题在于，越来越多的活细胞被理解为整体，因此将检验它们之间的相互作用。结果，样品不再是二维的，而是具有有限的厚度。在使用宽场显微镜进行观察期间，导致所需信号与未清晰地成像到传感器上的散焦光叠加在一起。因此，所寻求的信息有时无法检测或仅在对比度差的情况下才可检测到。因此，在不破坏样品的情况下，允许进行光学切片的技术，也就是说，测量各个样品平面，而对其他平面的信号进行抑制或区分是必不可少的。

共焦激光扫描显微镜(LSM)已被建设为检测光学切片的标准；它非常有效地阻挡了共焦针孔处的散焦光，并在检测之前辨别出该光。但是，由于扫描顺序地建立图像，因此LSM非常慢。此外，在给定固有的短像素时间的情况下，相对高的光强度，即能量的量被输入到样品中，以便仍然实现可接受的信噪比。因此，在活细胞的情况下，LSM不理想地适合于成像。

随着DLP技术(DLP＝数字光处理)的发展，文献中已经讨论了所谓的可编程阵列显微镜(PAM)。在这种情况下，将DMD阵列放置在显微镜的中间图像平面中，并利用激发光照明。然后通过DMD激活照明图案，以便同时在多个位置上照明样品。然后再次经由相同的DMD阵列指引样品中激发的荧光，并且传递以在矩阵传感器，通常为sCMOS上进行检测。因此，DMD阵列同时用作激励针孔矩阵和检测针孔矩阵。然后，系统地切换DMD阵列的激励图案，直到实现对样品平面的完全扫描为止。

由于通过PAM实际上可实现任何期望的大小的并行化，因此仅受相机的图像记录速率限制的帧速率是可能的。但是，与LSM相比，像素的停留时间增加，因此可以大大降低每个样品位置的平均激光功率。然后仍然有可能根据样品厚度改变平行度，以便提高与散焦光的对比度。这不利于帧速率或像素停留时间。