[发明专利]用于将mRNA转染到细胞中的组合物及其应用

说明书

本发明涉及用于将信使RNA(mRNA)转染到细胞中的组合物及其应用。本发明涉及用于将mRNA转染到细胞中的组合物，所述组合物包含mRNA、至少一种中性脂质和式(I)的阳离子脂质，其中R₁、R₂、R₃、R₄和R₅、(CH₂)_n和A^‑如本说明书中所定义。本发明还涉及所述组合物的用途和体外转染活细胞的方法。

本发明涉及用于将信使RNA(mRNA)转染到细胞中的组合物及其应用。本发明涉及用于将mRNA转染到细胞中的组合物，所述组合物包含mRNA、至少一种中性脂质和式(I)的阳离子脂质，其中R₁、R₂、R₃、R₄和R₅、(CH₂)_n和A^-如本说明书中所定义。本发明还涉及所述组合物的用途和体外转染活细胞的方法。

将遗传物质引入细胞中对现代生物学和医学的发展至关重要，并为我们提供了许多有关基因功能和调控的知识。在几乎所有情况下，都已将DNA用于转染目的，因为其具有固有的稳定性以及整合到宿主基因组中从而产生稳定转染子的能力。有多种方法可以将遗传物质引入细胞中。这些方法包括简单的操作，例如将DNA与磷酸钙、DEAE-葡聚糖、聚赖氨酸或载体蛋白混合。其他方法包括显微注射、电穿孔、原生质体融合、脂质体、基因枪递送、阳离子聚合物和病毒载体，等等。

转染质粒DNA是在培养中生长的细胞中过度表达蛋白质的最简单且最常见的方法。当该方法失败时，转染试剂通常被视为罪魁祸首，或者简单地认为细胞“难以转染”。

然而，不是DNA的摄取/递送，而是其一旦进入细胞内的处理可能是该技术的主要限制。在最终翻译成蛋白质之前，到达并穿透细胞核、将mRNA转录并释放到细胞质中都是关键步骤。

涉及使用现有阳离子聚合物基因载体进行细胞转染的主要问题是在接近所需的转染效率的同时面临较高的细胞毒性。

那么用mRNA序列而不是质粒DNA构建体转染细胞为显著提高大多数细胞类型中的瞬时蛋白表达水平提供了很好的机会，并为具有挑战性的细胞提供了独特的选择。

转染的mRNA不需要到达细胞核即可进行细胞作用。翻译是通过不依赖启动子的过程进行的，并且早在转染后6小时就可以检测到所需的蛋白质。

先前在1989年(Malone等人，1989)描述过使用转染步骤将mRNA引入哺乳动物细胞，但是由于mRNA缺乏稳定性，因此其使用在很长一段时间内受到限制。另一个问题是外源mRNA是免疫原性的并且通过Toll样受体(TLR)识别诱导强免疫应答(Heil等人，2004；Kariko等人，2004)。然而，核苷的适当化学修饰可以减少免疫激活以及mRNA降解。已证明含有5-甲基胞苷、N⁶-甲基腺苷、5-甲基尿苷、假尿苷或2-硫代尿苷的RNA能够非常有效地降低TLR活化(Kariko等人，2005)。还据报道，通过HPLC纯化包含修饰核苷的体外转录的mRNA是去除RNA系污染物的有力方法，这些污染物可能具有免疫原性。因此，质量改善的mRNA抑制免疫激活并显著提高翻译效率(Kariko等人，2011)。

近年来，使用转染的mRNA生产所需的蛋白质越来越受欢迎。表达的瞬时特征很具吸引力且非常适合于许多应用，在这些应用中，细胞内蛋白或肽的产生以及膜或分泌蛋白的表达都是必要的。例如，在递送编码转录和重编程因子的mRNA后，将体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)被证明是非常有效的。与病毒方法相比，该过程更安全，因为这是在基因组中的非整合方法(Yoshioka等人，2013；Warren等人，2010)。在递送mRNA后，还可以实现干细胞向体细胞的分化，其中该应用需要分化因子的瞬时和快速表达。将mRNA或长RNA(例如基因组病毒RNA))引入生产者细胞也与产生重组蛋白、抗体或重组病毒有关。