[发明专利]新纯化方法

说明书

本发明涉及纯化多肽的方法。更特别地，本发明涉及从包含目的多肽和杂质的样品中纯化所述目的多肽的改进的方法。在所述改进的方法中，澄清和第一纯化步骤是仅是一个步骤的一部分。

技术领域

本发明涉及纯化多肽的方法。更特别地，本发明涉及从包含目的多肽(polypeptide of interest)和杂质的样品中纯化所述目的多肽的改进的方法。在所述改进的方法中，澄清和第一纯化步骤是仅是一个步骤的一部分。

背景技术

通常来说，在生物技术中获得诸如多肽的药物物质的制造过程分为几个步骤。首先，用发酵罐(微生物过程)或生物反应器(哺乳动物过程)大量产生表达目的分子(molecule of interest)的宿主细胞。在培养步骤结束时，收获目的分子，该步骤通过离心或通过过滤进行。

如果目的分子不溶(基本上对于微生物过程)，则必须先进行重折叠步骤以获得可溶形式。

得到澄清的产物，下一步是色谱技术以捕获分子并去除一些污染物。此步骤称为捕获。总是需要额外的色谱步骤来精制分子，该步骤是抛光步骤，随后是超滤以浓缩目的分子，以及渗滤步骤以在指定条件下配制产品。例如，WO9747650描述了一种多肽的纯化方法，该方法涉及澄清，随后是两个离子交换色谱步骤，或者WO0048703提出了在澄清步骤之后使用至少一个错流过滤来纯化多肽。

为了改善通常是耗时且非常昂贵的所述纯化步骤的时间和成本，对于进一步的纯化方法存在需要。

发明内容

如本文所述，本发明涉及一种从含有目的多肽和杂质的样品中纯化所述目的多肽的方法，所述方法包含以下步骤：i)使含有目的多肽和杂质的样品与色谱树脂接触，而不对样品进行初始澄清步骤；ii)将步骤i)的样品与色谱树脂一起孵育足够的时间，以使树脂结合目的多肽，优选在搅拌条件下进行；iii)在中空纤维或任何切向过滤系统中再循环色谱树脂，浓缩或不浓缩目的多肽以获得更小的体积；iv)通过渗滤清洗含有目的多肽和杂质的样品，以去除杂质；v)从色谱树脂洗脱目的多肽；vi)通过渗滤从色谱树脂回收纯化的目的多肽。

根据本发明所使用的色谱树脂可以选自由蛋白A、蛋白A相关、阳离子交换、阴离子交换或混合模式树脂所组成的组。

根据本发明待纯化的含有所述目的多肽和杂质的样品，优选为来自细胞培养物的收获液或细胞培养物，其可以是粗收获液或粗细胞培养物(例如，当目的多肽已被分泌时)或已进行裂解、溶解和重折叠的收获液或细胞培养物(例如，当多肽已在细胞的细胞质或周质中可溶的或以包涵体在内部产生时)。

根据本发明的目的多肽已在重组宿主中产生，并由重组宿主分泌或包含在重组宿主的细胞质或周质内部。优选地，重组宿主是诸如细菌的原核细胞或诸如酵母的低等真核细胞。在一个优选的实施方式中，目的多肽选自由重组蛋白、融合蛋白、免疫球蛋白或抗体或其任何片段所组成的组。

定义

根据本领域使用术语“缓冲液”。“平衡缓冲液”是用于制备色谱树脂以接收待纯化样品的缓冲液。“上样缓冲液”是指用于将样品上样到色谱柱或过滤器的缓冲液。“清洗缓冲液”是用于清洗树脂的缓冲液。根据色谱的模式，将允许去除杂质(在结合/洗脱模式下)或收集纯化的样品(在流通模式下)。“洗脱缓冲液”是指用于将样品与色谱材料解除结合(unbind)的缓冲液。由于上样/清洗缓冲液和洗脱缓冲液之间的缓冲液化学性质(例如，离子强度和/或pH)的改变，因此这是可行的。含有目的多肽的纯化样品将由此收集为洗脱液。

术语“树脂”或“色谱材料”是指允许从杂质中分离出待纯化的多肽的任何固相。所述树脂或色谱材料可以是亲和性、阴离子、阳离子或混合模式树脂/色谱材料。根据本发明的树脂应当是基于球形珠粒的树脂。