[发明专利]在自动化模块和仪器中对经核酸酶经编辑的序列的改进的检测

说明书

本公开内容提供了模块、仪器和方法，以富集经由核酸引导的核酸酶编辑活细胞而编辑的细胞。

相关申请

本国际PCT申请要求2018年8月30日提交的美国临时申请第62/724,851号和2019年1月23日提交的美国临时申请第62/795,739号的优先权，为了所有目的将两者通过引用以其整体并入。

发明领域

本发明涉及用于核酸引导的核酸酶编辑和经编辑的活细胞的富集的自动化模块、仪器和方法。

发明背景

在以下讨论中，为了背景和介绍的目的，将会描述某些文章和方法。本文中包含的任何内容均不得解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留在适当的情况下证明本文所引用的方法在适用法律条文下不构成现有技术的权利。

对活细胞基因组进行精确、靶向性改变的能力一直是生物医学研究和开发中的长期目标。最近，已鉴定出多种核酸酶，它们允许操纵基因序列，从而操纵基因功能。核酸酶包括核酸引导的核酸酶，使研究人员能够在活细胞中产生永久性编辑。在细胞群体中的编辑效率可以很高；然而，由于未经编辑的细胞缺少编辑过程中发生的双链DNA断裂，因此在汇集(pool)或多重化形式中未经编辑的细胞往往被选择性富集。双链DNA断裂极大地负面影响细胞存活力，从而导致未经编辑的细胞的存活率增强，并使得难以鉴定经编辑的细胞。此外，具有赋予生长优势或劣势的编辑的细胞可以导致群体中不同编辑的占比(representation)出现偏倚。

因此，在核酸引导的核酸酶基因编辑领域中需要改进的用于在细胞群体中生成编辑的方法以及改进的用于富集和选择经编辑的细胞的方法。本发明满足了这种需求。

发明概述

本概述被提供用于以简化的形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述并不意图用于标识所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。根据下面的书面详细描述，包括在附图中示出并且在所附权利要求中定义的那些方面，所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将变得明显。

本公开内容提供了用于自动化高通量富集经核酸引导的核酸酶编辑的细胞的方法、模块和仪器。该方法利用了在细胞生长周期中特定的点诱导编辑的优势，其中核酸酶和gRNA中的一种或两者在诱导型启动子的控制下。当细胞培养物达到生长静止期(stationary phase of growth)时(或细胞培养物即将达到生长静止期之前)诱导编辑克服了来自未经编辑的细胞的生长偏倚、来自差异编辑率的生长效应以及不同编辑的适应性效应导致的生长偏倚。实际上，已经确定消除生长率偏倚使得观察到的编辑效率比传统方法提高多达3-4x或更多。

因此，本文提供了包括用于执行经核酸引导的核酸酶编辑的细胞的富集的方法的实施方案，该方法包括：在生长培养基中提供转化的细胞，其中细胞包含核酸引导的核酸酶编辑组分，并且其中至少gRNA在诱导型启动子的控制下；允许转化的细胞生长直至细胞生长至对数期的至少60％；诱导一种或更多种核酸引导的核酸酶编辑组分的转录；并允许细胞进行编辑并且然后生长。在一些方面，核酸引导的核酸酶编辑组分在单个载体上提供至细胞，并且在一些方面，细胞为细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。在一些方面，该方法还包括在第二允许步骤之后，使细胞成为电感受态(electrocompetent)并且用第二轮核酸引导的核酸酶编辑组分转化细胞的步骤，其中至少gRNA在诱导型启动子的控制下。在又一些方面，在诱导一种或更多种核酸引导的核酸酶编辑组分的转录之前，使细胞生长直至它们至少生长至对数期的75％、对数期的80％、对数期的85％、对数期的90％、对数期的95％或处于生长静止期。

在一些方面，诱导型启动子为在温度升高时活化的启动子，并且在一些方面，诱导型启动子为pL启动子，其中通过将细胞的温度升高至42℃来诱导转录。在又其他方面，诱导型启动子为在添加诱导部分后被活化的启动子。