[发明专利]用于CRISPR的靶标无关的向导RNA

权利要求书

1.一种获得靶标多核苷酸的富集群体的方法，包括：

(i)提供起始寡核苷酸的库，该起始寡核苷酸的库用于制备用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成的单一向导RNA合成的单一向导RNA(sgRNA)的库，其中所述起始寡核苷酸包含启动子节段、作为靶标特异性序列的随机节段和结合节段，所述结合节段与支架序列的至少一部分互补以与sgRNA引导的核酸结合蛋白相互作用；

(ii)提供一种或多种正义和/或反义链捕捉子寡核苷酸，其与所述靶标特异性序列的至少一部分互补，包含能够结合同源相互作用子的标签；

(iii)使所述起始寡核苷酸的库与所述一种或多种正义和/或反义链捕捉子寡核苷酸杂交；

(iv)通过使所述标签与同源相互作用子结合，所述同源相互作用子优选位于磁珠或适合的表面上，从所述起始寡核苷酸的库中去除起始寡核苷酸和正义链捕捉子寡核苷酸的复合物和/或起始寡核苷酸和反义链捕捉子寡核苷酸的复合物，从而获得减少的起始寡核苷酸的库；

(v)使用在步骤(iv)中获得的所述减少的起始寡核苷酸的库制备sgRNA的库；

(vi)使用在步骤(v)中获得的所述sgRNA的库，以sgRNA引导的核酸结合蛋白切割从测试样品获得的多核苷酸混合物；和

(vii)从在步骤(vi)中获得的所述多核苷酸混合物尺寸选择未切割的靶标多核苷酸。

2.一种获得用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的靶标无关的合成的单一向导RNA(sgRNA)的库的方法，包括：

(i)提供起始寡核苷酸的库，该起始寡核苷酸的库用于制备用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成的单一向导RNA(sgRNA)的库，其中所述起始寡核苷酸包含启动子节段、作为靶标特异性序列的随机节段和结合节段，该结合节段与支架序列的至少一部分互补以与所述sgRNA引导的核酸结合蛋白相互作用；

(ii)提供一种或多种正义和/或反义链捕捉子寡核苷酸，其与所述靶标特异性序列的至少一部分互补，包含能够结合同源相互作用子的标签；

(iii)使所述起始寡核苷酸的库与所述一种或多种正义和/或反义链捕捉子寡核苷酸杂交；

(iv)使所述标签与同源相互作用子结合，所述同源相互作用子优选位于磁珠或适合的表面上，从所述起始寡核苷酸的库中去除起始寡核苷酸和正义链捕捉子寡核苷酸的复合物和/或起始寡核苷酸和反义链捕捉子寡核苷酸的复合物，由此获得减少的起始寡核苷酸的库；和

(v)使用在步骤(iv)中获得的所述减少的起始寡核苷酸的库制备靶标无关的sgRNA的库。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述sgRNA引导的核酸结合蛋白为DNA结合性Cas蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述DNA结合性Cas蛋白是Cas9蛋白家庭的成员，优选Cas9蛋白或其衍生物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述随机节段包含约10至30个随机核苷酸，优选20个随机核苷酸。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述捕捉子寡核苷酸包含约10至30个核苷酸，优选20个核苷酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，能够与同源相互作用子结合的所述标签是生物素并且其中所述同源相互作用子为链霉亲和素。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，步骤(iii)至(iv)重复1、2、3、4、5或更多次。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述靶标多核苷酸代表基因、基因的一个或多个外显子、基因间区域、非转录调控区域和/或开放阅读框或它们的子部分；或一组不同的基因、一组不同基因的一个或多个外显子、一组基因间区域、一组非转录调控区域和/或一组开放阅读框或它们的子部分，或任何前述元件的任何组合。