[发明专利]用于CRISPR的靶标无关的向导RNA

说明书

本发明涉及一种使用用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成的单一向导RNA(sgRNA)获得靶标多核苷酸的富集群体的方法，以及一种获得用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的靶标无关的合成的单一向导RNA(sgRNA)的库的方法。还提供了一种通过本发明的方法可获得的靶标多核苷酸和sgRNA。进一步设想了一种包含通过本发明的方法可获得的sgRNA的库的试剂盒以及通过本发明的方法可获得的sgRNA的库的用途。

技术领域

本发明涉及一种使用用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成的单一向导RNA(sgRNA)获得靶标多核苷酸的富集群体的方法，以及涉及一种获得用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的靶标无关的合成的单一向导RNA(sgRNA)的库的方法。还提供了一种通过本发明的方法可获得的靶标多核苷酸和sgRNA。进一步设想了一种包含通过本发明的方法可获得的sgRNA的库的试剂盒，以及通过本发明的方法可获得的sgRNA的库的用途。

背景技术

下一代测序(NGS)是遗传学和分子研究的主要驱动力，尤其包括在癌症医学领域中的现代诊断。该技术为研究DNA或RNA样品提供了强有力的方法。已经开发出新的和改进的方法和协议以支持各种应用，包括分析遗传变异和样品特异性差异。为了改进这种方法，已经开发出了旨在通过聚焦于特定序列、转录本、基因或基因组子区域或通过消除不需要的序列来靶向富集测序文库的方法。

靶向富集在许多情况下可能有用，例如需要分析整个基因组的特定部分的情况。完整外显子组(所有转录序列)的有效测序是此方法的典型示例。进一步的实例包括特定转录本的富集，突变热点的富集或干扰核酸物种的排除。

当前用于靶向富集的技术包括(i)杂交捕获，其中源自输入样品的核酸链在溶液中或在固相支持物上和与靶向目标区域互补的DNA片段特异性杂交，这样就可以从物理上捕获并分离出目标序列；(ii)选择性环化或分子反转探针(MIP)，其中通过间隙填充和连接化学以高度特异性方式形成了包括靶标区域序列的单链DNA环，创建具有常见DNA元件的结构，然后将其用于选择性扩增靶向的目标区域；和(iii)聚合酶链反应(PCR)扩增，其中通过并行进行多重长距离PCR、有限数量的标准多重PCR或扩增非常大数量短片段的高度多重PCR，将PCR导向靶向的目标区域(Mertes et al.,2011,Briefings in functionalGenomics,10,6,374-386)。

最近，将CRISPR/Cas技术用于靶向富集目的，特别是为了从测序文库中去除不需要的序列。

CRISPR/Cas技术是一种新型且非常通用的基因组和表观基因组编辑工具，其基于重新利用CRISPR/Cas(聚簇的规则穿插的短回文重复序列/Cas)细菌免疫系统(Cong etal,2013,Science,339,819–824)。当Cas核酸酶与称为单一向导RNA(sgRNA)的短RNA寡核苷酸复合时，可在特定sgRNA互补位置诱导双链断裂(DSB)。

CRISPR/Cas系统还被重新用作可编程的限制性内切酶，以非常精确和定制的方式指导切割(Lee et al.,2015,Nucleic Acids Res.,43,1–9)。

因此，已经开发出使用CRISPR/Cas的方法，该方法在称为通过杂交耗尽大量序列(DASH)的过程中选择性地耗尽过剩序列。DASH用于通过指导靶向切割并阻止进一步扩增和测序去除靶标，例如从mRNA-seq中去除核糖体RNA(rRNA)和从癌症样品中去除野生型KRAS背景序列(Gu et al.,2016.Genome Biol.,17,41)。根据Gu et al.，在转座子介导的片段化之后但在随后的扩增步骤(这取决于片段两端是否存在衔接子序列)之前使用DASH，能够防止靶标序列的扩增(线粒体rRNA)，从而确保它们不出现在最终测序文库中。

但是，这种富集方法适用于仅从测序文库中去除特定物种，而所有其他序列仍保留在文库中。因此，需要一种精简的、对成本和资源敏感的富集和测序方法，其可以有效降低测序文库的复杂性，从而降低测序深度并减少了要处理的数据量。