[发明专利]来自单个生物样品的蛋白质、核糖体和无细胞核酸的同时基于测序的分析

说明书

本发明提供了一种在简化的组合工作流程中分析生物样品以测定其中多种类型信息的方法，其中所有信息都是在基于测序的分析中获得的。这些信息包括血液样品中特定血浆蛋白的存在和浓度；与从同一样品中获得的无细胞DNA相关的组蛋白修饰的数量、位置和类型；无细胞DNA样品中cfRNA和cfDNA的序列；和关于无细胞DNA的表观遗传学信息，例如羟甲基化和甲基化图谱，即分别为5‑羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5‑甲基胞嘧啶(5mC)残基的分布。本发明还涉及一种用于分析生物样品以测定样品的一个或更多个非经典序列特征的基于经典测序的方法。还提供了组合物、试剂盒和相关方法，包括其中将截短的测序衔接子与条形码化PCR引物结合使用的实施方案。

技术领域

本发明一般地涉及表观遗传学分析，并且更具体地涉及用于从单个生物样品获得多种类型信息的组合工作流程方法。本发明发现可用于基因组学、医学、诊断学和表观遗传学研究的领域。

技术背景

从包含微量分析物的相对较小的生物样品中获取大量信息具有独特的挑战。例如，无细胞DNA(cfDNA)样品通常每毫升血浆仅包含几纳克的DNA。结果是，难以评估无细胞DNA样品的多于一个或两个特征，例如DNA序列信息和/或甲基化数据，每个特征经常使用单独的工作流程，将已少量的DNA样品分开作为输入，并且限制了可获知的关于同一起始分子的信息量(例如，如果单个起始cfDNA片段模板包含甲基化细胞因子和羟甲基化细胞因子二者)。然而，已经提出了一种用于从一个cfDNA样品中获得不同类型信息的方法。参见，例如，Arensdorf等的于2018年2月14日提交的临时美国专利申请序列号62/630,798的“Methodsfor the Epigenetic Analysis of DNA,Particularly Cell-Free DNA”(BluestarGenomics,Inc.)，其描述了一种用于检测单个无细胞DNA样品中的不同表观遗传学特征的方法，包括DNA片段的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)残基的存在和位置，其中最终将经差异加工的DNA片段合并并一起测序以提供期望的信息；以及Song等的美国专利公开号2017/0298422 A1的“Simultaneous Single-Molecule Epigenetic Imaging ofDNA Methylation and Hydroxymethylation”(小利兰·斯坦福大学董事会)，其描述了将不同的标记与无细胞DNA的5mC和5hmC结合，然后检测和分析通过标记产生的信号。还参见Reuter等的专利公开号2018/0080021的“Simultaneous Sequencing of RNA and DNAfrom the Same Sample”，其涉及一种从单个生物样品中扩增和测序RNA和DNA二者的方法。

如果可以从单个小体积生物样品中获得多得多的信息，这将是极其有用的，包括但不限于关于DNA序列、DNA表观遗传学修饰、RNA序列、核小体结构和定位、组蛋白修饰以及核酸相关和游离血浆蛋白二者的信息。此外，如果此种全面的数据集可以以基本上相同的方式并在组合工作流程的背景下从单个小体积生物样品中产生，无需并行加工、另外的样品材料或多种信息产生方法论，这将是理想的。最后，到可以将此种非序列信息一起编码(例如在序列中，但使用标准的未经修饰的核酸碱基)在同一模板核酸中，并与原始亲本模板序列一起通过后续步骤的加工的程度，这将增强与现有研究工作流程和二代测序文库制备技术的兼容性。最具体地，这将使得能够使用提取、扩增和检测技术，这些提取、扩增和检测技术原本可从相关序列中稀释或分离此种非序列信息。

发明内容

本发明针对本领域中的前述需求，并且在一个实施方案中，提供了一种用于分析生物样品以测定其中的多种类型信息的组合工作流程方法，无需许多独立的分析步骤、多种数据生成方式或大量样品样品。可以从患者的血液样品中获得的信息类型包括例如特定血浆蛋白的存在和浓度；与cfDNA(例如血液样品中无细胞级分的DNA)相关的组蛋白修饰的数量、位置和类型；该级分中cfRNA和cfDNA的序列；关于无细胞DNA的表观遗传学信息，例如羟甲基化和甲基化图谱，即分别地5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲基胞嘧啶(5mC)残基的分布。