[发明专利]基因组编辑方法与构建体

权利要求书

1.一种将外源性DNA序列整合到细胞基因组中的方法，其包括使细胞接触：

a)供体核酸，其包含：

-至少一个终止密码子和翻译起始序列(TIS)或，

-核糖体跳跃序列，和

-所述外源性DNA序列，

其中，所述供体核酸在5'和3'侧接反向靶向序列；

b)与所述靶向序列同源的互补链寡核苷酸，和

c)识别所述靶向序列的核酸酶。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述翻译起始序列(TIS)是kozak共有序列或IRES序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中，核糖体跳跃序列是T2A，P2A，E2A，F2A，优选T2A序列，优选所述IRES序列是60-70bp，优选约50bp，更优选50bp的合成序列。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述供体核酸包含：

-至少一个终止密码子，和

-翻译起始序列(TIS)，其中所述TIS是kozak序列或IRES序列，所述IRES序列是60-70bp，优选约50bp，更优选50bp和40bp的合成序列，和

-所述外源性DNA序列。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述供体核酸包含三个可能框中的终止密码子，优选地，所述三个可能框中的终止密码子包含或由插入各框中的两个终止密码子组成，优选地，所述三个可能框中的终止密码子包括或由SEQ ID NO:1(TAATAAATAATAAATAATAA)的序列或其排列组成。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

a)kozak共有序列包括或基本上由下述组成：

-与SEQ ID NO:54(gccacc)或其功能片段具有至少98％相同性的序列或，

-序列SEQ ID NO:55(gccncc)，其中n可以是g或a，和/或

b)所述IRES序列包含或基本上由与SEQ ID NO:24

(TgACAAACTgTACATgCCgTTAACTgTAATTTTgCgTgATTTTTTTgTAg)或SEQ ID NO:23

(AggTggTAgCCgCAAACATAgTTCAATACAAACTTgCTgTCTCggCgg)或其功能片段具有至少95％相同性的序列组成，

c)所述核糖体跳跃序列包含或基本上由与SEQ ID NO:32

(ggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct)或SEQ IDNO:25-28的编码序列或其功能片段具有至少80％相同性的序列组成和/或，

d)所述靶向序列包含或基本上由与SEQ ID NO:29

(GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、SEQ ID NO:30

(AGTACTGCGGATACTCAAAG)、SEQ ID NO:31

(ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列组成和/或，

e)所述与所述靶向序列同源的互补链寡核苷酸包含或基本上由与SEQ ID NO:56(CCAGGTAGTACTGCGGCTGC)、SEQ ID NO:57

(CTTTGAGTATCCGCAGTACT)、SEQ ID NO:58

(ATGGGCGATCTCACTCTTGT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列组成。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述供体核酸还包含聚腺苷酸化信号，优选牛生长激素多聚A。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述靶向序列是包含在视紫红质(Rho)或肝脏表达的基因(例如白蛋白基因)中的序列。