[发明专利]基因组编辑方法与构建体

说明书

本发明涉及将外源性DNA序列整合到细胞基因组中的方法，其包括令细胞接触：a)供体核酸，其包含：‑至少一个终止密码子和翻译起始序列(TIS)或‑核糖体跳跃序列，和‑所述外源性DNA序列，其中，所述供体核酸在5'和3'侧接反向靶向序列；b)与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和c)识别靶向序列的核酸酶。

技术领域

本发明涉及将外源性DNA序列整合到细胞基因组中的方法，其包括令细胞接触供体核酸、与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和识别靶向序列的核酸酶。本发明还涉及包含所述供体核酸和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和 /或核酸酶的载体以及其医药用途。

背景技术

孟德尔遗传疾病作为显性遗传病，由于传统基因治疗只能替代基因功能并且不能避免功能获得性(GOF)突变的退行性影响，给治疗带来了难题。在过去的几年中，基因组编辑已经成为治疗显性遗传疾病的一个可行的选择。基因组编辑使用内切核酸酶，通常是CRISPR/Cas9[1，2]。CRISPR-Cas9是这样的核糖核蛋白，其结合称为向导RNA(gRNA)的序列并通过沃森克里克碱基互补识别靶DNA序列。这个靶DNA序列必须邻近原型间隔子-邻近基序(PAM) 序列，其允许Cas9结合DNA并切割靶序列[3]。基于RNA的Cas9靶向有助于靶向不同基因座的设计，并且甚至允许通过将Cas9和2个不同的gRNA递送到同一细胞来靶向2个不同的序列。Cas9靶向基因组中的特定位置后，其产生双链制动(brake)(DSB)，其将通过以下两种修复机制之一修复：

非同源末端连接(NHEJ)是大多数细胞类型中最主要的机制，因为其在细胞周期的所有阶段都具有活性，并且包括在DSB位点插入或缺失随机碱基以修复DSB。这种随机插入或缺失(INDEL(插入缺失))常导致阅读框改变，从而敲除靶向的基因的表达[3]。等位基因特异性敲除GOF突变应当使得野生型拷贝不受影响，从而维持基因的正常功能，同时避免GOF等位基因的影响[4]。虽然该方法使用具有广泛活性的NHEJ修复途径，但是其应用受到这样的限制： GOF等位基因处gRNA/PAM组合的可用性以及其使用局限于特定突变，即各突变应具有其自己的一组治疗性AAV载体；