[发明专利]用于将非肝细胞重编程为肝细胞的组合物和方法

权利要求书

1.用于将非肝细胞诱导成肝细胞样细胞(iHep)的方法，其包括以下步骤：

(a)处理所述非肝细胞，以上调造血表达的同源盒蛋白(HHEX)、肝细胞核因子4-α(HNF4A)、肝细胞核因子6-αA(HNF6A)、GATA4和叉头盒蛋白A2(FOXA2)、MYC，并下调p53基因表达和/或蛋白活性；

(b)在体细胞培养基中培养所述非肝细胞；

(c)在包含至少一种糖原合酶激酶(GSK)抑制剂和至少一种TGFβ受体抑制剂的肝细胞扩增培养基HEM中扩增所述细胞；以及

(d)在包含至少一种环腺苷酸(cAMP)激动剂和至少一种TGFβ受体抑制剂的肝细胞分化培养基中培养所述细胞；

其中，在步骤(c)中，所述肝细胞扩增培养基HEM包含B27、烟酰胺、2-磷酸-L-抗坏血酸、GSK抑制剂、TGFβ抑制剂、鞘氨醇-1-磷酸酯(S1P)、溶血磷脂酸(LPA)和表皮生长因子(EGF)，其中所述B27不含VA；

其中，所述肝细胞分化培养基是在基础培养基中补充有包含至少一种环腺苷酸(cAMP)激动剂和至少一种TGFβ受体抑制剂的培养基，其中所述基础培养基为HCM或William’s E培养基；

其中，所述非肝细胞为人成纤维细胞。

2.权利要求1所述的方法，其包括用表达p53 SiRNA的载体转染所述非肝细胞。

3.权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在体细胞培养基中培养至少7天的时期。

4.权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在HEM中培养15至30天、或20-30天、或20-25天的时期。

5.权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在肝细胞分化培养基中培养至少5天的时期。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述TGFβ受体抑制剂是SB431542(4-[4-(1,3-苯并二噁唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、E-616452([2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶]。

7.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述cAMP激动剂是毛喉素或dbcAMP。

8.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述GSK抑制剂是CHIR99021([6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈])。

9.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在肝细胞分化培养基中培养后，所述细胞是ALB+，其中所述ALB+细胞构成超过90％的细胞群。

10.权利要求1所述的方法，其进一步包括使用选自下列的至少一种特征来鉴定iHep：(a)典型的肝细胞形态学，其类似于来自从其获得所述非肝细胞的生物体的培养的原代肝细胞；(b)E-钙黏着蛋白、白蛋白(ALB)和/或选自HNF4A、HNF1A、CEBPA和CEBPB的肝转录因子的表达；(c)关键药物代谢酶CYP450s、UGT1A1和POR的表达；和(d)对于低密度脂蛋白(LDL)摄取、脂肪滴合成和糖原合成的胜任性。