[发明专利]用于将非肝细胞重编程为肝细胞的组合物和方法

说明书

提供了用于将非肝细胞诱导成肝细胞样细胞的方法，其中将该非肝细胞诱导以表达或过表达肝命运转化和成熟因子，在体细胞培养基、肝细胞扩增培养基和2C培养基中培养足够的时期，以将非肝细胞转化为具有肝细胞样特性的细胞。也提供了根据该方法诱导的iHep。

发明领域

本发明一般性地涉及用于将真核细胞重编程为具有肝细胞样特征的细胞的转录因子以及小分子的应用。

发明背景

近来在使用各种转录因子重编程中的进展已允许在成熟体细胞类型之间的转化。

先前的研究鉴定了HNF1A、HNF4A、HNF6、ATF5、PROX1和CEBPA的组合，其用于使用定义的细胞培养方案从非肝细胞获得肝细胞样细胞。Du等人,Cell Stem Cell,14:394-403(2014)。

但是，试图将一个细胞谱系直接转化为另一个的当前的方法遭受几个缺点，包括初始细胞的剩余记忆和靶细胞的有限功能转化(Cahan等人,Cell,158:903-915(2014))。Zaret等人注意到直接重编程例如包装的H3K9me3异染色质结构域的外遗传屏障，其对于转录因子(TF)进入用于激活靶细胞的组织特异性基因是困难的，导致不完全的细胞命运转化(Becker等人,Trends in Genetics,32:29-41(2016))。其它研究观察到，通过直接成纤维细胞至肝细胞转化策略的位于H3K9me3结构域中的关键肝基因的仅有限的激活(Gao等人,Stem Cell Reports,9:1813-1824(2017)；Becker等人,Mol.Cell.,68:1023-1037e1015(2017))。

因此，对下列方法存在需求，其将非肝细胞诱导成功能性诱导的肝细胞，所述肝细胞在与已知的诱导的肝细胞相比时显示改善的肝细胞功能活性。

因此，本发明的一个目的是提供诱导非肝细胞转化为具有代谢功能的诱导的肝细胞(iHep)的方法。

提供具有代谢功能的诱导的肝细胞也是本发明的一个目的。

本发明的又一个目的是，提供使用诱导的肝细胞用于药物开发、生物人工肝系统以及体内和体外肝应用的方法。

本发明的又一个目的是提供用于将非肝细胞重编程为iHep的试剂盒。

发明概述

公开了用于诱导将不是肝细胞的第一类细胞(即非肝细胞)重编程为肝细胞样细胞的方法，如通过功能性肝药物代谢和转运能力所指示。这些细胞在本文中称为诱导的肝细胞(iHep)。将非肝细胞处理以上调肝细胞诱导因子，在体细胞培养基中培养(转化阶段)，在肝细胞培养基中扩增(扩增阶段)，并在2C培养基中进一步培养(成熟阶段)足够的时期，以将该细胞转化为具有肝细胞样特性的细胞。

重编程方法包括两个阶段，肝祖细胞生成阶段(阶段I)和诱导的肝细胞(iHep)生成阶段(阶段II)。阶段I包括下列步骤：(a)处理细胞，以便上调肝细胞诱导因子和MYC，并下调p53和在细胞培养基中培养细胞(转化阶段)；和(b)重新铺板和在HEM(肝扩增培养基)中培养细胞(扩增阶段)。阶段II包括在定制分化培养基例如本文公开的2C培养基中培养细胞。按照此细胞培养方案获得诱导的肝细胞(iHep)。

在阶段I(a)中，优选将非肝细胞转化以过表达下列肝细胞诱导因子：造血表达的同源盒蛋白(HHEX)，肝细胞核因子4-α(HNF4A)，肝细胞核因子6-αA(HNF6A)，GATA4和叉头盒蛋白A2(forkhead box protein A2，FOXA2)，MYC；并下调p53基因表达和/或蛋白活性。非肝细胞(经处理以上调肝细胞诱导因子和MYC并下调p53)然后在HEM(肝扩增培养基)中在体外培养和扩增(扩增阶段)，并且肝祖细胞在阶段1中产生。这些肝祖细胞在细胞培养基中进一步成熟，所述培养基补充有至少一种环腺苷酸激动剂和至少一种TGFβ受体抑制剂(称为2C)，以在阶段II(成熟阶段)中获得iHep。