[发明专利]采用拉曼光谱确定病毒滴度的方法

说明书

公开了拉曼光谱用于监测和评估病毒滴度的用途。一种采用拉曼光谱定量样本中病毒滴度的方法，包括以下步骤：(a)提供样本并用光源照射样本；(b)测量多个波数范围中的每一个内的拉曼散射光的总强度以获得样本的波数强度数据集，其中多个波数范围是预先选择的并且表征样本中的病毒；(c)对波数强度数据执行数学数据处理步骤；和(d)基于数学数据处理步骤的输出定量病毒滴度。

技术领域

本发明涉及拉曼光谱在监测和评估病毒滴度中的用途。

背景技术

病毒载体制造是许多细胞和基因疗法生产的关键过程步骤，该行业的增长已导致对病毒载体供应的需求增加。鉴于此，重要的是分析工具是可利用的，以确保可以监控和优化病毒载体生产过程，并且可以定量和表征病毒载体产品。对病毒载体的需求和生产成本都对生产过程中获得良好的病毒载体滴度具有特别重要的影响。目前，物理病毒滴度测量通常通过标准分析技术进行，例如对于慢病毒滴度，经常使用ELISA(酶联免疫吸附测定)来评估p24或qPCR以测量病毒RNA，对于AAV，经常使用带有靶向ITR的引物的RT qPCR。然而，这些方法耗时、通常不准确并且需要对介质进行采样。因此，这些方法仅提供病毒浓度的回顾性测量。因此，需要新的测量病毒滴度的方法。

拉曼光谱是一种振动形式的光谱，其已被证明在需要分子信息的过程分析技术(PAT)应用中具有特殊的实用性。该技术基于检测光子中的波数偏移，该光子已被样本中存在的分子非弹性散射(其中此类光子的波数差异与光子因特定分子的振动状态从基态改变为第一激发态引起的能量损失有关，或者与光子从去激发分子自激发振动态到基态所获得的能量有关)。与以前用于PAT应用的方法相比，该技术具有许多优势，最显著的是与其他系统相比，相对较弱的信号是由水产生的，这有助于生物过程监测、细胞培养分析和溶液中的蛋白质分析。例如，拉曼光谱已被用于方差检验和确定原材料和细胞培养基的身份；表征大分子产品；分析药物配方、批次间的可变性、污染、培养基降解、细胞密度(包括活细胞密度和总细胞密度)、蛋白质结构和蛋白质稳定性；用于聚合物和纤维分析；用于材料ID测试和用于葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸(lactate)和氨的定量。Buckley和Ryder(2017)对拉曼光谱的适用性进行了综述。

然而，传统的拉曼光谱与弱信号的产生有关，据报道弱信号影响其在生物领域中经常需要的敏感定量分析的使用。事实上，据报道，使用传统拉曼光谱检测葡萄糖的浓度极限为0.6mM，据报道检测苯丙氨酸的浓度极限为1.1mM(Buckley和Ryder,2017,AppliedSpectroscopy,71,p1085-1116)(估计为分别相当于0.11mg/ml和0.18mg/ml)。鉴于此，本领域主要使用传统的拉曼光谱来评估细胞培养基和细胞生长，并且在需要更灵敏的测量时采用了其他方法，例如检测在所报告的传统拉曼光谱检测限值以下的实体，如病毒颗粒。在这方面，Lee等人(2015)描述了使用表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced RamanSpectroscopy，SERS)检测HIV-1。SERS与传统拉曼不同，它提供来自附着在纳米级粗糙金属表面的分子(例如Ag、Cu或Au)的增强信号。在Lee等人中，包含结合的抗gp120抗体片段的Au纳米点制造的铟锡氧化物基底用于特异性结合HIV-1病毒样颗粒，以确保产生增强的信号用于HIV-1病毒样颗粒检测。然而，SERS与限制有关，限制包括需要预先准备具有适当免疫相互作用分子的底物(其限制了该技术的一般应用)以及与此相关的成本增加。此外，要求与感兴趣实体相结合，鉴于这一性质，SERS在样本中始终是侵入性的。

因此，需要其他的方法来表征和评估可能与敏感或弱信号相关的实体，例如病毒，并原位评估此类实体。

发明内容