[发明专利]一种生产3-氨基异丁酸的酶突变体

说明书

本发明公开了一种S‑腺苷基‑L‑甲硫氨酸δ24‑固醇‑C‑甲基转移酶突变体C24MTgm‑M11。根据酶突变体的编码多核苷酸构建菌株MG1655(ΔptsGΔfumACΔfumB,panD,aspA,C24MTgm)，菌株MG1655(Δpts GΔfumACΔfumB,panD,aspA,C24MTgm‑M11)可以在摇瓶发酵下产生480mg/L的3‑氨基异丁酸。相较野生型菌株C24MTgm，含有突变体C24MTgm‑M11的菌株显着提高5.8倍的3‑氨基丁酸产量。

技术领域

本发明涉及代谢工程领域，特别是涉及构建生产3-氨基异异丁酸的菌株与其方法，以及透过基因工程菌株生产3-氨基异异丁酸的方法。

背景技术

3-氨基异丁酸(3-aminoisobutyric acid)，也称为β-氨基异丁酸(β-AIB)或3-氨基-2-甲基丙酸，其化学式如下：

3-氨基异丁酸为非蛋白氨基酸，一种胸腺嘧啶和缬氨酸的代谢物，其在尿液中会被排出。3-氨基异丁酸的R-构型衍生自胸腺嘧啶，而S构型衍生自缬氨酸，尿液中的R构型占比估计超过90％。目前已经发现，β-AIB作为肌肉激素的第一个代表性小分子，属于白色脂肪组织生热过程的非肾上腺素能活化剂家族，具有针对II型糖尿病和代谢疾病的良好药物潜力。此外，3-氨基异丁酸可用作化学原料和药物中间体。3-氨基异丁酸作为有机合成的原料，其具有20多种上游产物和10多种下游产物；而其在药物中间体领域的应用和研究则是非常广泛。

目前，3-氨基异丁酸主要通过化学方法制备。虽然产物的产率高，但在合成步骤中需要昂贵的催化剂和大量的盐酸，同时也会产生高度毒性的氰化物，造成环境的巨大污染。随着环境保护的要求增加，因此有必要开发环境友善、绿色的生产方法。2018年，CN108998401A公开了一种通过大肠杆菌工程发酵产生β-AIB的方法。在该专利中，从野生菌株MG1655剔除了三种基因ptsG、fumAC和fumB，并且高表达了三种基因，为L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD、天冬氨酸酶基因aspA和甲基转移酶基因C24MTgm。基因剔除所获得的工程菌株可以在摇瓶中生产100mg/L的β-AIB，这代表着β-AIB作为生物制剂的可能性。然而，该工程菌株的β-AIB产量仍较低，因此尚有相当大的改进空间。

发明内容

为了克服3-氨基异丁酸化学合成方法产生的污染问题和因发酵而3-氨基异丁酸的产量低问题，本发明利用了来自大豆(Glycine max)的S-腺苷基-L-甲硫氨酸δ24-固醇-C-甲基转移酶(S-adenosyl-L-methionineδ24-sterol-C-methyltransferase)突变体C24MTgm-M11，构建其过表达载体pSU-lacIqTrc-C24MTgm-M11，并将其导入MG1655(ΔptsGΔfumA CΔfumB,panD,aspA)(见CN108998401A)，最后所获得的表达菌株可以显着提高3-氨基异丁酸发酵产量。

具体地，本发明包括以下技术解决方案：

一种制备生产3-氨基异丁酸菌株的方法，包括以下步骤：

A.构建表达质粒pSU-lacIqTrc-C24MTgm-M11，其源自大豆的S-腺苷基-L-甲硫氨酸δ24-固醇-C-甲基转移酶突变体；

B.将步骤A中得到的质粒转化为MG1655(ΔptsGΔfumACΔfumB,panD,aspA)，得到基因工程菌株MG1655(ΔptsGΔfumAC fumB,panD,aspA,C24MTgm-M11)。

在一实施方式中，本发明提供了一种甲基转移酶突变体C24MTgm-M11，其衍生自序列为SEQ ID NO：1的野生型酶C24MTgm，其中位置135的脯氨酸被丙氨酸取代，位置136的白氨酸被丙氨酸代替，位置213的苯丙氨酸取代丝氨酸。

进一步地，甲基转移酶突变体C24MTgm-M11包括氨基酸序列SEQ ID NO:3。